表皮鞣化和先天免疫这两个生理过程对昆虫的生存和繁殖必不可少。前者通过色素沉着和表皮硬化参与维持昆虫体表完整性、正常蜕皮行为及保护机体免受外源性物理伤害,后者则可通过调控黑色素的合成参与吞噬、包被病原体以及伤口的愈合等过程。因此,黑色素代谢途径与以上两个生理过程密切相关,并均通过多巴及其衍生物来实现。在此过程中,四氢生物喋呤是酪氨酸羟化酶羟化酪氨酸合成多巴中所必须的辅助因子,而鸟苷三磷酸环化水解酶(Punch)则是作为合成四氢生物喋呤的唯一限速酶。鸟苷三磷酸环化水解酶(Punch)在脊椎动物以及无脊椎动物中高度保守,先前的研究表明其在双翅目以及鳞翅目昆虫表皮黑色素形成中具有重要作用,而在鞘翅目中未见报道。为探究鞘翅目昆虫中鸟苷三磷酸环化水解酶的功能,我们以赤拟谷盗(Tribolium castaneum)为研究对象展开相关研究。利用PCR获得赤拟谷盗Punch的ORF序列。该基因全长771bp,含有四个外显子,编码含有256个氨基酸的蛋白序列。多重序列分析显示赤拟谷盗Punch与其他昆虫的同源蛋白序列高度相似。为探究赤拟谷盗Punch在表皮黑色素形成中的重要作用及其调控机制,本研究利用q RT-PCR分析赤拟谷盗Punch基因的时空表达模式。结果显示Punch在早期成虫显著高表达,且随着色素沉着的完成而逐步减少。组织表达模式显示Punch在赤拟谷盗成虫鞘翅中高表达,表明Punch基因可能与赤拟谷盗表皮鞣化有关。随后利用RNA干扰技术敲低Punch基因表达后发现,蛹虽正常发育为成虫,但成虫表皮的黑色素沉着却发生了延迟,最终的表皮变得比正常的锈色略浅。并且ELISA检测结果显示多巴胺的含量显著下降。之后的四氢生物喋呤互补实验能够使成虫的表型得到恢复。为研究赤拟谷盗Punch与免疫的相关性,利用q RT-PCR分析了Punch基因在赤拟谷盗幼虫时期的组织表达模式,结果显示不仅在表皮中高表达,而且在脂肪体、血淋巴等免疫相关组织中也呈现高表达。这一结果暗示着Punch有可能参与到赤拟谷盗的免疫过程中。幼虫用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌刺激过后的3小时Punch基因表达量被显著诱导,并且在6小时Punch的表达量达到最高,随后表达倍数迅速下降到与对照组持平,表明赤拟谷盗在免疫防御中通过增加Punch表达来发挥重要的作用。进一步检测赤拟谷盗Punch基因干扰后血淋巴自发黑化的情况显示,与对照组相比,干扰组的血淋巴没有发生明显的自主黑化。最后通过死亡率统计结果发现,在注射大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌之后的72小时内,干扰组的累计死亡率达到了60%左右,而WT和IB组只有30%的死亡率。以上结果表明,干扰Punch表达的赤拟谷盗更易遭受金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的感染,表明了Punch在赤拟谷盗的免疫过程中发挥重要作用。为了进一步明确Punch在赤拟谷盗中的信号转导网络,我们利用RNA-seq技术对赤拟谷盗幼虫进行转录组学的分析。测序共检测出了797个差异表达基因,其中506个基因上调,191个基因下调。差异表达基因富集的GO term及KEGG pathway显示,Punch干扰后不仅造成了酪氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸代谢途径发生紊乱,还使DNA的复制过程和昆虫激素合成过程受到了阻碍。