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背景与目的甲状腺癌是头颈部常见的恶性肿瘤,约占全身恶性肿瘤的1%,近年来其发展率呈上升趋势。甲状腺癌按病理类型可分为：乳头状癌、滤泡状癌、髓样癌和未分化癌。其中,乳头状癌是最常见的甲状腺恶性肿瘤,约占甲状腺癌的60%-70%。目前,虽然对甲状腺癌的癌变机制取得一定的进展,但是具体的分子生物学机制尚不清楚。肿瘤的发生是一个多因素、多阶段、多基因参与的长期复杂的过程。基因序列的改变如基因突变、基因杂合性缺失、微卫星不稳定等可导致肿瘤的发生,然而近来发现某些肿瘤抑制基因其基因序列完整并未发现突变、缺失等变化,利用经典的遗传控制理论难以解释此现象。表遗传学(epigenetics)是指发生在基因表达水平上的可遗传的、无DNA序列改变。主要包括DNA甲基化和组蛋白去乙酰化,其中,DNA甲基化是表遗传学调控的主要方式。DNA甲基化是表观遗传学上研究最深入的一种机制,被认为是继突变、等位基因丢失后致抑癌基因失活的第二次打击。目前研究发现在许多肿瘤中存在RUNX3的失活,包括胃癌、肺癌、胆管癌、胰腺癌和肝细胞癌等,其失活的机制主要是基因启动子区域CpG岛的甲基化。Runx3基因在甲状腺乳头状癌中基因启动子甲基化及其蛋白表达缺失的关系国内外尚未见文献报道。为此,我们首先运用甲基化聚合酶链反应(MSP)来从DNA水平检测PTC中Runx3基因的启动子甲基化情况,并分析其与临床病理参数的关系。来探讨Runx3基因在甲状腺乳头状癌中失活的可能机制,进而来评判Runx3基因是否是甲状腺癌的候选抑癌基因。其次,为证明由于基因启动子区的高甲基化而导致基因表达下调或缺失,我们运用半定量RT-PCR法从RNA水平检测Runx3基因在PTC中的转录情况,并分析其与临床病理参数的关系。最后,为近一步证明mRNA转录与蛋白表达的一致性,我们运用Western blot法从蛋白水平检测Runx3基因在PTC中的表达情况,并分析其与临床病理参数的关系。通过MSP、RT-PCR、Western-blot来进一步探讨Runx3抑癌基因在甲状腺乳头状癌中发生、发展以及转移侵袭中的作用,寻求肿瘤治疗的靶点,为临床上的肿瘤筛选及预后提供生物学标记作为依据。材料与方法1.56例PTC及其切缘与癌灶相隔2cm的非癌上皮(non-carcerous epithelium, NCE)组织,均经病理证实,分别取自2008年1月至2010年3月郑州大学第一附属医院手术标本。所有病例术前均未接受化疗、放疗及其他免疫治疗。标本放入液氮后保存于—80℃低温冰箱中,一部分用于提取DNA和甲基化修饰用于MSP反应,一部分用于提RNA和蛋白用于RT-PCR及Western blot检测。2.采用MSP法检测Runx3基因启动子区域的甲基化状态。采用RT-PCR及Western blot法从RNA及蛋白水平检测Runx3基因的转录及表达情况。3.采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。数据处理两样本率的比较采用四格表资料的χ2检验,两样本定量资料采用t检验,以P<0.05为差异显著性的标准。结果1.在NCE组中,无一例出现Runx3基因启动子区域的甲基化,而在PTC组中,有35.7%(20/56)出现甲基化,两组之间有显著性差异(P<0.05)Runx3基因启动子区域的甲基化状态与PTC患者的TNM分期、病理分级及淋巴结转移有关(P<0.05);而与患者的性别、年龄及肿瘤大小无关(P>0.05)。2.在NCE组中,均可见Runx3基因mRNA的转录,而在PTC组中,有57.1%(32/56)出现转录缺失或下调,两组之间有显著性差异(P＜O.05)。Runx3基因mRNA的转录与PTC患者的病理分级及淋巴结转移有关(P<0.05)而与患者的性别、TNM分期、年龄及肿瘤大小无关(P>0.05)3.56例NCE组中,均可见Runx3蛋白表达,而在PTC组中,有60.7%(34/56)出现表达缺失或下调,两组之间有显著性差异(P<0.05)。Runx3基因mRNA的转录与PTC患者的TNM分期、病理分级及淋巴结转移有关(P<0.05);而与患者的性别、年龄及肿瘤大小无关(P>0.05)。4.56例PTC中,Runx3基因启动子甲基化阳性大多伴随Runx3蛋白阴性,两者有明显的负相关性(P<0.05)；Runx3基因mRNA转录与蛋白表达大多具有一致性(P<0.05)。结论1. Runx3基因在甲状腺乳头状癌中存在明显的表达缺失或下调,在癌旁组织中表达正常。并且Runx3基因的表达失活与患者的TNM分期、病理分级及淋巴结转移有关可能成为PTC新的候选抑癌基因之一。2. Runx3基因启动子区域高甲基化是Runx3基因表达失活的主要机制,在甲状腺乳头状癌的发生发展中起重要作用。为临床上肿瘤药物治疗提供靶点。3. Runx3基因甲基化与表达失活均与患者病理分级及淋巴结转移有关,为临床上的肿瘤筛选及预后提供生物学标记作为依据。