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研究背景及研究目的:急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction,AMI）是缺血性心脏病中常见的重症疾病,具有较高的发病率和致死率。在过去几十年中,随着再灌注治疗方法的出现,急性心肌梗死后患者的存活率显著增高,但仍然面临着术后高达40%的死亡率。CD38是一种多功能的跨膜蛋白,最初是在淋巴细胞中发现,随后被证明在多种细胞类型中均有表达。CD38参与了哺乳动物细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的降解,敲除CD38可显著增加细胞内NAD+水平。NAD+作为哺乳动物细胞内的重要辅酶,参与机体的许多重要生物学过程,例如氧化还原、代谢及DNA修复等。我们的前期研究显示,全身性敲除CD38基因或补充外源性NAD+能有效地保护心脏的缺血再灌注（Ischemia-reperfusion,IR）损伤。急性心肌梗死后的急性损伤期以及随后的心肌修复期是由多种细胞如心肌细胞、不同来源的巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞等共同参与的复杂病理生理过程。心肌细胞作为心脏中占比最大的细胞群体（约占细胞总体积的75%）是心肌梗死中受损最为严重的细胞,而具有重要免疫调节作用的巨噬细胞在急性心肌梗死的不同阶段发挥重要作用。因此,本研究拟使用心肌细胞特异性CD38敲除小鼠以及巨噬细胞特异性CD38敲除小鼠,探讨不同细胞类型中的CD38对缺血性心脏病导致的心肌损伤发生和修复过程的作用及其机制,为临床上预防和治疗急性心肌梗死提供新的策略和实验依据。实验方法:1.心肌细胞或巨噬细胞特异性CD38敲除鼠的制备及鉴定:在CD38基因的2和3号外显子的两侧插入Flox位点以制备CD38flox/flox小鼠,后者与Mlc-Cre小鼠和Lyz-Cre小鼠杂交分别获得心肌细胞特异性CD38敲除小鼠（CD38flox/floxMlc-Cre小鼠）和单核细胞来源的巨噬细胞特异性CD38敲除小鼠（CD38flox/floxLyz-Cre小鼠）。Q-PCR和Western blot用于小鼠的基因型鉴定及检测心脏组织和巨噬细胞中CD38的敲除效率。2.急性心肌梗死模型的建立:取6-8周的雄性CD38flox/floxMlc-Cre、CD38flox/floxLyz-Cre以及CD38flox/flox小鼠,用异氟烷麻醉并固定于恒温加热板上,酒精消毒小鼠的胸腔部分,使用脱毛膏剔除小鼠胸腔部分的毛发。用剪刀将胸腔开1-2 cm的开口,钝器分离小鼠3-4位置的肋骨,暴露心脏,用7-0无菌线快速结扎冠状动脉左前降支,一旦心脏底部变成白色,迅速用4-0的无菌线缝合胸腔。对照组为假手术组,仅将胸腔打开,暴露冠状动脉左前降支,不进行结扎操作。3.组织特异性敲除CD38基因对急性心肌梗死损伤的影响及表型分析:1)检测小鼠在造模后第3、7和28天的超声心脏图变化,检测的指标主要有:射血分数（EF）、缩短分数（FS）、左心室舒张末期内径（LVIDd）和左心室收缩末期内径（LVIDs）;2)观察小鼠在造模后28天内的生存率;3)检测造模后第28天血清中LDH含量以及心脏/体重比和心脏/胫骨长度比;4)Masson染色和天狼星红染色检测心脏梗死区以及梗死边缘胶原沉积情况。4.机制分析:分别在体内和体外研究心肌细胞特异性敲除CD38对缺氧诱导心肌细胞凋亡、线粒体功能以及成纤维细胞转化的影响:1)提取造模后第7天小鼠的心脏组织蛋白,同时分离线粒体蛋白,检测胞质以及线粒体中促凋亡基因Bax以及抗凋亡基因BCL2的表达情况;检测胞质中凋亡相关指标Pro-Caspase3以及Cleaved-Caspase3的蛋白表达;检测线粒体功能相关蛋白,包括线粒体融合蛋白Mfn1和Mfn2以及线粒体分裂蛋白Drp-1的变化;对模型后第28天的小鼠心脏组织进行切片染色,分析梗死区域以及非梗死区域的胶原沉积情况;Western blot以及免疫荧光对成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转变的指标进行检测,如α-SMA及TGF-β等。2)构建CD38敲低的大鼠心肌细胞系H9c2,首先进行低氧处理,在不同的时间点用细胞流式仪检测心肌细胞凋亡和线粒体膜电位变化,Western blot和Q-PCR检测BCL2及Bax等的变化。3)通过Western blot检测心肌组织或心肌细胞Sirt3的蛋白情况,观察Sirt3抑制剂对CD38缺失的原代心肌细胞的细胞凋亡和线粒体膜电位的影响。实验结果:1.成功构建了 CD38flox/floxMlc-Cre 小鼠以及 CD38flox/floxLyz-Cre 小鼠:通过 RT-PCR 检测,证实 CD38flox/flox 鼠、CD3 8flox/floxMlc-Cre 小鼠以及 CD3 8flox/floxLyz-Cre小鼠的目的DNA条带分别为313bp,450bp和700bp,与各转基因鼠的基因型目的条带相符。Western blot以及Q-PCR检测结果显示,CD38flox/floxMlc-Cre小鼠心脏组织的CD38表达量与CD38flox/flox小鼠相比减少了 90%以上,而CD38flox/floxLyz-Cre小鼠的腹腔巨噬细胞（PM）和骨髓来源的巨噬细胞（BM）的CD38表达量与CD38flox/flox小鼠相比,分别下降了 70%左右和80%左右。结果提示,我们成功构建了 CD38flox/floxMlc-Cre小鼠以及CD38flox/floxLyz-Cre 小鼠。2.成功构建了小鼠急性心肌梗死模型:小鼠经冠状动脉左前降支结扎后,通过超声心脏图检测假手术小鼠以及模型小鼠的心功能变化,结果显示模型小鼠的射血分数、缩短分数、左心室收缩末期内径及左心室舒张末期内径均有明显的改变,假手术组则没有明显变化。TTC染色显示,模型小鼠的心脏存有明显的梗死区域。结果显示,我们成功构建了小鼠急性心肌梗死模型。3.急性心肌梗死模型的表型分析:与对照组相比,造模后CD38flox/floxMlc-Cre小鼠的存活率明显增加,心功能如射血分数、缩短分数、左心室收缩末期内径和左心室舒张末期内径等显著改善,但CD38flox/floxLyz-Cre小鼠的存活率及心功能无明显改变。此外,心肌细胞特异性CD38缺失能明显降低由缺血造成的LDH含量升高,心脏/体重比和心脏/胫骨长度比有所下降,心脏梗死区的胶原沉积显著增加,梗死边缘则相反;巨噬细胞特异性CD38缺失小鼠在造模后,其心功能、存活率以及组织学染色结果均显示与对照小鼠没有明显差异。4.机制分析:1)Western blot结果显示,CD38flox/floxMlc-Cre小鼠在造模后第7天可显著增加心肌组织抗凋亡基因BCL2由胞质向线粒体转运,降低由缺血诱导的细胞凋亡及胞质中Cleaved-Caspase3的表达,而促凋亡基因Bax则无明显变化;2)CD38缺失可显著增加线粒体融合蛋白Mfn-1和Mfn-2的表达,线粒体分裂蛋白Drp-1则没有明显变化;3)组织学染色以及蛋白检测结果显示,CD38缺失后能显著增加梗死区肌成纤维细胞相关基因的表达;4)在细胞水平,敲低CD38可以显著降低缺氧诱导的细胞凋亡、改善缺氧诱导的线粒体膜电位下降、增加抗凋亡基因BCL2向线粒体转运,降低胞质中Cleaved-Caspase3的蛋白表达以及增加缺氧条件下线粒体融合蛋白Mfn2的表达;5)CD38缺失可显著增加缺氧条件下Sirt3的表达,而Sirt3抑制剂则可显著抑制CD38缺失对缺氧诱导细胞凋亡以及线粒体膜电位的保护作用。结论:1.心肌细胞特异性敲除CD38明显改善急性心肌梗死小鼠的心功能以及存活率,但巨噬细胞特异性敲除CD38则无保护作用。2.CD38缺失通过增加抗凋亡基因BCL2由胞质向线粒体转运以及改善缺氧诱导线粒体功能障碍以防止缺氧导致大量心肌细胞的死亡。3.CD38缺失对缺氧诱导心肌细胞凋亡的保护作用主要是通过激活NAD+/Sirt3信号途径而实现的。