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苹果病毒病害是造成我国苹果“单产低、品质差”现状的主要原因之一。苹果病毒病有很强的危害性，而且会造成树体系统侵染，果树感染后终生带毒，跟“癌症”一样难以治愈。苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)在我国苹果园中发病率很高，普遍发病，该病毒除了可以侵染所有的仁果类植物外，也可以侵染核果类果树，此外一些野生植物也是该病毒的寄主，常规的苹果品种一般不表现明显的症状，但通过调查发现感染病毒的果树嫁接亲和性及果树的发育会严重受到影响。与其它病毒混合侵染时产量下降能够达到60％，比单独侵染造成的产量下降高20％。果树为多年生木本植物，果树病毒的研究与其它作物病毒相比，难度相对较大，病毒与寄主互作、寄主基因功能等方面研究还有待深入。本研究利用Pull down技术从苏俄苹果总蛋白中钓取与ACLSV CP、P50蛋白互作的寄主蛋白;然后利用酵母双杂交、双分子荧光互补技术对关键因子PR10与病毒的互作进行互作验证;采用RealtimeRT-PCR技术初步揭示ACLSV CP、P50和苏俄苹果PR10在寄主中的协同变化情况;明确苏俄苹果PR10蛋白的体外核酸酶活性;最后通过瞬时表达技术阐明ACLSV CP在本氏烟叶表皮细胞中的亚细胞定位情况。希望能够推进苹果病毒与寄主互作研究的深入。主要研究结果如下:
1.利用Pull down技术自苏俄苹果中钓取与ACLSV CP、P50互作的寄主蛋白。首先提取苏俄苹果总蛋白，以实验室前期表达纯化的带有His标签的CP、P50为诱饵蛋白，利用His Pull down技术钓取互作苹果寄主靶蛋白，通过质谱分析获得互作蛋白信息。经分析表明:共获得11个可能与P50互作的有价值的苹果蛋白，11个可能与CP互作的苹果蛋白。蛋白功能包括氧化还原酶活性、ATP结合活性、镁离子结合活性、铜离子结合活性、胺氧化酶活性、DNA结合功能、β葡糖苷酶活性、磷酸转移传感器激酶活性、病程相关蛋白等，其中PR10蛋白既与CP互作又与P50互作，且出现的频率最高。这与我们实验室前期的酵母双杂交筛选的结果相符。
2.利用酵母双杂交技术及双分子荧光互补技术验证了ACLSV CP、P50与PR10的互作。利用前期已经构建好的CP、P50诱饵载体及PR10捕获载体，通过共转化的方法转化到Y2Hgold酵母细胞中，涂布于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal四缺平板，通过菌落颜色的观察判定蛋白互作情况。另外，利用gate way技术构建ACLSV P50和PR10的入门载体pENTR-P50和pENTR-PR10，然后将入门载体与目标载体px-cYFP和px-nYFP进行LR重组，获得BiFC终载体P50-cYFP、P50-nYFP和PR10-cYFP、PR10-nYFP，转化农杆菌GV3101后注射本生烟进行荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察。结果表明:PR10捕获载体与CP、P50诱饵载体分别转化到酵母细胞中后，在四缺平板上菌落均显现为蓝色，酵母双杂交结果证明了PR10与CP和P50均互作。在双分子荧光互作实验中，经荧光显微镜观察和及激光共聚焦显微镜观察，本生烟叶片表皮细胞细胞质有黄绿色荧光被激发，证明了PR10与P50在细胞质中有互作。
3.采用Realtime RT-PCR技术初步揭示ACLSV CP、P50和苏俄苹果PR10在寄主中的协同变化情况。首先建立了ACLSV CP、P50和苏俄苹果PR10Realtime RT-PCR检测体系;将ACLSV接种于健康苏俄苹果组培苗上，在接种后20min、1d、5d、20d。进行三个基因表达的定量检测，结果表明:在侵染后1d，PR10表达量显著升高13倍，达到峰值，5d后表达量逐渐降低;CP和P50随着时间的积累病毒含量逐渐升高。
4.明确苏俄苹果PR10蛋白的体外核酸酶活性。首先构建了苏俄苹果PR10的原核表达载体pET28a-PR10，然后进行原核表达和纯化，最后将PR10与苏俄苹果总RNA混合，在25℃、37℃和60℃恒温处理2h，最后通过琼脂糖凝胶电泳和微量核酸浓度测定仪来测定PR10对RNA的降解作用。结果表明:经PR10处理的总RNA在琼脂糖凝胶电泳中RNA条带迁移率的相对较快;RNA的浓度及OD260/OD280无明显变化。
5.通过瞬时表达技术阐明ACLSV CP在本氏烟叶表皮细胞中的亚细胞定位情况。前期研究中激光共聚焦显微镜观察效果差，本研究利用前期构建好的CP瞬时表达载体pCam35s-gfp-CP，转化至农杆菌EHA105感受态细胞中注射本生烟，重复激光共聚焦显微镜观察，获得了非常好的结果，能够在本生烟表皮细胞的细胞质和细胞核中清晰的看到绿色荧光被激发，确定了CP定位于本生烟叶片表皮细胞的细胞质和细胞核中。
1.利用Pull down技术自苏俄苹果中钓取与ACLSV CP、P50互作的寄主蛋白。首先提取苏俄苹果总蛋白，以实验室前期表达纯化的带有His标签的CP、P50为诱饵蛋白，利用His Pull down技术钓取互作苹果寄主靶蛋白，通过质谱分析获得互作蛋白信息。经分析表明:共获得11个可能与P50互作的有价值的苹果蛋白，11个可能与CP互作的苹果蛋白。蛋白功能包括氧化还原酶活性、ATP结合活性、镁离子结合活性、铜离子结合活性、胺氧化酶活性、DNA结合功能、β葡糖苷酶活性、磷酸转移传感器激酶活性、病程相关蛋白等，其中PR10蛋白既与CP互作又与P50互作，且出现的频率最高。这与我们实验室前期的酵母双杂交筛选的结果相符。
2.利用酵母双杂交技术及双分子荧光互补技术验证了ACLSV CP、P50与PR10的互作。利用前期已经构建好的CP、P50诱饵载体及PR10捕获载体，通过共转化的方法转化到Y2Hgold酵母细胞中，涂布于SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal四缺平板，通过菌落颜色的观察判定蛋白互作情况。另外，利用gate way技术构建ACLSV P50和PR10的入门载体pENTR-P50和pENTR-PR10，然后将入门载体与目标载体px-cYFP和px-nYFP进行LR重组，获得BiFC终载体P50-cYFP、P50-nYFP和PR10-cYFP、PR10-nYFP，转化农杆菌GV3101后注射本生烟进行荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察。结果表明:PR10捕获载体与CP、P50诱饵载体分别转化到酵母细胞中后，在四缺平板上菌落均显现为蓝色，酵母双杂交结果证明了PR10与CP和P50均互作。在双分子荧光互作实验中，经荧光显微镜观察和及激光共聚焦显微镜观察，本生烟叶片表皮细胞细胞质有黄绿色荧光被激发，证明了PR10与P50在细胞质中有互作。
3.采用Realtime RT-PCR技术初步揭示ACLSV CP、P50和苏俄苹果PR10在寄主中的协同变化情况。首先建立了ACLSV CP、P50和苏俄苹果PR10Realtime RT-PCR检测体系;将ACLSV接种于健康苏俄苹果组培苗上，在接种后20min、1d、5d、20d。进行三个基因表达的定量检测，结果表明:在侵染后1d，PR10表达量显著升高13倍，达到峰值，5d后表达量逐渐降低;CP和P50随着时间的积累病毒含量逐渐升高。
4.明确苏俄苹果PR10蛋白的体外核酸酶活性。首先构建了苏俄苹果PR10的原核表达载体pET28a-PR10，然后进行原核表达和纯化，最后将PR10与苏俄苹果总RNA混合，在25℃、37℃和60℃恒温处理2h，最后通过琼脂糖凝胶电泳和微量核酸浓度测定仪来测定PR10对RNA的降解作用。结果表明:经PR10处理的总RNA在琼脂糖凝胶电泳中RNA条带迁移率的相对较快;RNA的浓度及OD260/OD280无明显变化。
5.通过瞬时表达技术阐明ACLSV CP在本氏烟叶表皮细胞中的亚细胞定位情况。前期研究中激光共聚焦显微镜观察效果差，本研究利用前期构建好的CP瞬时表达载体pCam35s-gfp-CP，转化至农杆菌EHA105感受态细胞中注射本生烟，重复激光共聚焦显微镜观察，获得了非常好的结果，能够在本生烟表皮细胞的细胞质和细胞核中清晰的看到绿色荧光被激发，确定了CP定位于本生烟叶片表皮细胞的细胞质和细胞核中。