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近年来RNA分子领域相关技术突破性进展,mRNA疫苗在流感病毒、埃博拉病毒和寨卡病毒等多种传染病上取得了一定的研究成果,mRNA疫苗将mRNA传递至细胞,表达产生蛋白,从而使机体获得免疫保护。mRNA作为疫苗分子相对于DNA分子具有突出的优点:它不需要任何的核定位信号、体内无需转录使突变风险大大降低且不存在整合到基因组的可能。猪伪狂犬病是当今危害养猪业最重要的传染病之一,疫苗免疫仍是防控伪狂犬病的最主要方式。然而2012年起,伪狂犬病毒变异株在全国多地流行,造成了养猪业的巨大经济损失。本研究以囊膜糖蛋白gD其分子和功能特性为基础,创新地研究PRV囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗作为候选疫苗对PRV的防治有着重要的潜在价值。猪伪狂犬病毒XJ株为病毒模板,扩增克隆囊膜糖蛋白gD基因,扩增后的囊膜糖蛋白gD基因构建mRNA克隆载体、真核表达载体,实现体外转录mRNA后再与真核表达载体分别进行免疫原性相关研究。主要研究内容为:1.囊膜糖蛋白gD基因的扩增与质粒构建使用生物学软件Premier5.0、Oligo6.0及BLAST对比并参考本实验相关研究,设计了两对特异性引物,第一对引物分别在5’和3’引入BamHI和XhoI酶切位点,第二对引物分别在5’和3’引入Bam HI、T7启动子和XhoI酶切位点。以Vero细胞培养增殖的PRV-XJ病毒抽提的DNA为模板,扩增两段目的片段后分别连接pMD19-T克隆载体和PVAX真核表达载体,构建的克隆重组载体pMD19-gD和真核表达载体PVAX-gD进行双酶切鉴定,送公司测序鉴定,与预期目的基因序列完全一致。2.囊膜糖蛋白gD基因体外转录,mRNA疫苗及PVAX-gD真核表达载体免疫原性相关研究。pMD19-gD酶切后回收获得线性化含有T7启动子的囊膜糖蛋白gD基因片段,加入体外转录体系后获得mRNA,将囊膜糖蛋白gD基因mRNA和真核表达质粒PVAX-gD转染BHK21细胞,40h后富集细胞进行western blot验证,有明确的特异性条带。将囊膜糖蛋白gD基因mRNA脂质体包被制成mRNA疫苗,mRNA疫苗、PVAX-gD真核表达载体进行动物实验,五组BALB/c小鼠大腿肌肉免疫两次,在首免后的第0、2、4、6、8周眼底静脉丛采血分别进行ELISA抗体检测、病毒中和抗体测定;在首免后第4周采血样ELISA检测细胞因子IL-2和IFN-γ的,同时进行流式细胞仪测定T淋巴细胞亚群变化情况。实验数据分析对比可得出,mRNA疫苗和PVAX-gD真核表达载体都可以诱导小鼠产生PRV gD特异性抗体和病毒中和抗体,在二免后,特异性抗体水平和病毒中和抗体效价都有显著提高。实验组CD4+/CD8+细胞占比例提高显著,实验组CD4+比例达到50%,相较于阴性组提高了18%;实验组CD8+比例达到16%,相较于阴性提高了3%以上。在IL-2中,mRNA+保护剂组、PVAX-gD组浓度超过阴性小鼠浓度的1.5倍,mRNA组接近;IFN-γ的浓度mRNA+保护剂组、PVAX-gD组为阴性小鼠的2倍,mRNA组接近阴性小鼠的2倍。攻毒保护试验进一步证明了囊膜糖蛋白gD基因mRNA疫苗能够抵御病毒攻击,与DNA疫苗效果持平可以诱导良好的体液免疫与细胞免疫应答。