现如今,荧光分子成像技术在近十年来取得了大幅的进步。而随着高分辨显微成像技术的发展,人们有能力用可视化的方法分析细胞内分子的含量与分布,并对生命活动的直观了解和深入研究有了更迫切的需求,因此急需越来越多的分子荧光成像探针或分子荧光团来匹配这些高速发展起来的技术。近年来,大量的可供选择的荧光团已经被研发设计出来用于单分子检测与分子成像的应用。这些通过合理设计出来的荧光分子为人类可视化细胞内分子提供了无限可能,并且不断有新颖的荧光分子被设计应用在不用方向。随着研究人员的不断努力,荧光探针以其高灵敏度、高特异性、快速响应和技术简洁的特点成为生物感应和生物成像的强大工具。在过去的十年里,研究人员在设计合成响应微环境变化（例如:pH、黏度和极性）或定量分析生物分子（例如:离子、活性氧和酶）的荧光探针方面取得了显著的进步。尽管荧光探针已经得到了广泛的应用,但仍然有许多缺点存在于传统的荧光探针之中,例如光漂白、细胞或组织的自发荧光干扰和穿透深度浅等,这依然限制荧光探针在生物样品中的应用。而被近红外激发的双光子（TP）荧光探针在生物成像中的应用可以得到改进的三维立体空间定位、增强成像深度,同时降低对生物样品的光毒性和光损伤,近年来得到了越来越多的关注。本论文以近红外激发双光子荧光探针为基础,构建出多种针对生物体内活性信号小分子检测的分子荧光探针,并完成在细胞体内进行成像检测。具体内容如下:（1）以分子内电荷转移（ICT）为基础,通过将双光子荧光染料4-羟基-1,8萘二甲酰亚胺修饰连接H₂S识别基团氰酸根基团（RO-CN）,构建完成比率型双光子荧光探针4-氰酸根-1,8萘二甲酰亚胺（Probe 1）。在H₂S存在时,H₂S将会与氰酸根反应生成活性中间体硫代氨基甲酸酯,而硫代氨基甲酸酯将会迅速水解,其羟基衍生物被释放进入溶液环境中,在这个过程中氰酸根将会断裂分开,而双光子荧光团被释放出来。该探针能够避免背景荧光的干扰,并且荧光发射强度比(F_{552 nm}/F_{448 nm})在H₂S的存在下有显著的加强,探针对H₂S展现出高灵敏度,最低检测限为0.24μΜ,响应时间在90 s内就能完全响应。相比于其他离子或生物活性物质,Probe 1对H₂S具有高选择性,能够在其他离子或生物活性物质干扰下准确检测H₂S。Probe 1成功应用于成像Hela细胞内源性和外源性的H₂S,并且被成功证实Probe 1具有双光子成像检测细胞内H₂S的能力。（2）构建以荧光共振能量转移（FRET）为基础的比率型双光子荧光探针TPR-O,用于检测超氧基自由基(O₂^·-)。首先合成一个以FRET为基础的比率型双光子荧光平台,Np-Rhod。该平台的装配是通过FRET策略直接连接一个D-π-A结构,双光子萘衍生物与对甲氨基酚荧光团结合。同时采用三氟甲基磺酸酯基团作为O₂^·-的识别单元,通过羟基连接至TP-FRET平台设计构建完成探针TPR-O。在缺乏O₂^·-时,受体呈现出非荧光内酯结构,FRET在关闭状态,并且探针TPR-O处于低荧光强度比(F_{541 nm}/F_{448 nm})状态。而当超氧基自由基与识别单元接触时,TP-FRET平台释放,FRET过程开始,结果导致高荧光强度比(F_{541 nm}/F_{448 nm})状态。TPR-O针对O₂^·-展现出高选择性和灵敏度,最低检测限为6.2 nM。更重要的是,TPR-O可以用来成像检测细胞内的O₂^·-。