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背景和目的：磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue, PTEN)是PI3K/Akt信号通路的重要负调因子,PTEN与维持正常B细胞功能有关。由于系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)最主要的免疫病理生理异常是B细胞过度活化增殖以及自身免疫性B细胞清除障碍,为确定PTEN是否在狼疮患者的免疫异常调节中扮演重要的角色,其表达与功能缺陷是否参与自身反应性B细胞的异常存活,本研究就此进行相关实验。研究方法：入组诊断明确的初治SLE患者26人,同期选取健康对照24例(年龄、性别匹配),采集外周静脉血,分离外周血单个核细胞(PBMC),磁珠分选纯化CD19+B细胞。流式细胞术检测外周血B细胞各亚群间PTEN的表达水平,并用流式细胞术与荧光定量PCR法分别检测并比较SLE患者与HC外周血B细胞中PTEN的蛋白与mRNA水平变化。统计PTEN的水平下降程度与SLE病情活动度与严重度之间的关系。给予IL-2、 IL-4、 IL-6、1L-10、IL-21、 CD40L以及anti-IgM等多种刺激条件培养B细胞72小时后流式细胞术及Western Blot检测PTEN的蛋白水平变化,主要研究IL-21对HCB细胞PTEN表达水平的调控以及这部分功能在SLE患者中存在的障碍。研究各亚群B细胞主要是不成熟B细胞比例变化以及其活化表型的表达情况。结果：1、在HC外周血B细胞各亚群上,其中Immature B细胞(主要由CD19+IgD+CD38intpre-naive B细胞以及CD19+lgD+CD38hi Transitional B细胞组成)与浆细胞(CD19+lgD-CD38int/hiB细胞)PTEN表达水平最高；2、与HC相比,SLE患者外周血B细胞中,除了记忆B细胞外,Immature B细胞,幼稚B细胞与浆细胞群中PTEN的表达均明显低表达。且总的B细胞中PTEN mRNA水平明显低于对照组；3、SLE患者总B细胞中PTEN的表达水平与SLEDAI评分呈明显负相关,与补体C3水平呈明显正相关,且在狼疮肾炎患者群体中,不同蛋白尿水平组之间,尿蛋白>1g组PTEN水平明显低于尿蛋白0.25～1g组,而尿蛋白0.25～1g组PTEN的水平明显低于尿蛋白阴性组；4、IL-21对HC外周血B细胞中PTEN的蛋白表达存在明显的上调作用,这种调控功能在SLE患者中缺失；IL-21对SLE患者与HC B细胞的PTEN mRNA水平均能够引起明显上调表达；5、SLE患者中immature B细胞比较明显高于HC,且细胞表达高表达CD95与CD86活化表型。结论：狼疮外周血B细胞上PTEN的表达量明显低于健康对照。且在SLE患者中,PTEN下降的水平与疾病的活动度与严重度呈明显相关性,但与抗dsDNA自身抗体的滴度之间未见明显相关。值得注意的是,IL-21的刺激可以使正常B细胞中PTEN蛋白表达水平升高,而这种作用在狼疮患者的B细胞上是缺失的。狼疮B细胞上PTEN的蛋白表达的异常可能出现在翻译后转录水平的调控上。PTEN的表达,调控与功能的缺陷,可能与系统性红斑狼疮中B细胞的高敏应答与稳态缺失有关。背景和目的系统性红斑狼疮(SLE)的发病机制复杂,其中B细胞过度活化增殖以及自身免疫性B细胞清除障碍是最主要的免疫病理生理异常。本研究第一部分发现IL-21对PTEN的mRNA水平调控在狼疮中与健康个体一致,但蛋白水平的调控异常。MiRNA转录后调控水平发挥重要功能。本实验实中前期发现SLE中miR-7异常高表达,生物信息学预测并以双荧光报告素酶系统验证PTEN是miR-7的作用靶点之一。本部分旨在研究与PTEN相关的miRNA,重点针对的miR-7,就其在SLE中可能存在的缺陷,及其与PTEN的表达和功能之间的关系进行探讨。研究方法入组诊断明确的初治SLE患者20人,同期选取健康对照15例(年龄、性别匹配),采集外周静脉血,分离外周血单个核细胞(PBMC),磁珠分选纯化CD19+B细胞。Real-time PCR (Taqman探针法)检测并比较SLE患者与HC外周血B细胞miR-7、 miR-21与miR-22的表达水平(ex vivo)。给予IL-21刺激体外培养B细胞48小时后Real-time PCR (Taqman探针法)检测SLE患者与HC外周血B细胞miR-7、 miR-21与miR-22的表达水平,与仅培养基孵育组相比较。建立电转染体系,将pre-miR-7、 anti-miR-7或对照microRNA转染入SLE患者与HC外周血B细胞,过表达或是抑制miR-7的表达水平(以real-time PCR (Taqman探针法)验证),体外培养48hr后Real-time PCR法(染料法)检测PTEN的mRNA水平,或用流式细胞术检测胞内PTEN的蛋白水平。以miR-7的antagomir转染SLE患者外周血B细胞,48hr后流式细胞术检测胞内PTEN的蛋白水平。结果1、SLE患者外周血B细胞中mir-7、 miR-21与miR-22的表达水平显著高于HC,具有统计学差异(p值分别为p=0.03,p=0.0001,p=0.0001)。2、加入IL-21体外培养48hr后,可以明显上调SLE患者与HC外周血B细胞miR-7(p值均小于0.05)和miR-22(p值均小于0.05)的表达水平。3、将pre-miR-7、 anti-miR-7或对照microRNA通过电转染的方式,可以过表达或是抑制外周血B细胞的miR-7表达水平。4、在SLE患者外周B细胞中通过电转染的方式过表达miR-7并不引起PTEN mRNA相对表达量明显变化,而转入anti-miR-7抑制miR-7的表达后可以明显的引起PTEN mRNA相对表达量的上调(p<0.05)。5、电转健康对照B细胞中过表达miR-7后可以引起PTEN的表达下调(p<0.05),而SLEB细胞中抑制miR-7的表达可以明显的引起PTEN水平的上调(p<0.05)。6、miR-7的antagomir转染SLE患者外周血B细胞,48hr后可以明显引起胞内PTEN的水平上调(p<0.05)。结论异常的microRNA表达可能与PTEN的调控缺陷有关。本研究证实miR-7同样可以引起PTEN表达水平的下降。对于miR-7与miR-22的调控可能是IL-21介导的PTEN基因表达和调节B细胞的功能的中心。背景和目的：B细胞的发展,活化和自身免疫耐受是由BCR所传递的信号控制下的一个相互关联的过程。PI3K信号的活化是BCR诱导信号的一个基本组成部分。BCR信号通过调控跨膜钙离子(CaIcium,Ca2+)的流动在B细胞的增殖、分化与凋亡中起重要作用(67)。其中PI(3,4,5)P3在Ca2+内流中起着一个关键的放大作用,PI3K通路除了是维持B细胞稳态与存活的重要通路外,同样影响着B细胞的分化。IL-21由活化的T辅助细胞产生的,是抗体类别重组以及浆细胞分化的一种强效诱导剂,可以在BCR信号与T辅助信号的共同作用下诱导浆细胞分化,AID.blimpl等的表达上调将促进B细胞向浆细胞方向分化。在本部分研究中,在狼疮中,PTEN表达的下调是否伴随着BCR信号下游的钙离子信号的放大,IL-21与B细胞增殖与浆细胞分化的关系以及miRNA在这部分B细胞功能方面究竟扮演什么样的角色是本部分研究的重点。研究方法：入组诊断明确的初治SLE患者21人,同期选取健康对照15例(年龄、性别匹配),采集外周静脉血,分离外周血单个核细胞(PBMC),磁珠分选纯化CD19+B细胞。Phosflow流式细胞术检测HC与SLE外周血B细胞中培养基对照、rIL.21. rCD40L+aIgM与rCD40L+algM+rIL-21刺激下Akt与STAT3的磷酸化水平变化。以Fluo-4染色后检测HC与SLE外周血B细胞(ex vivo)静息状态与BCR诱导下的钙离子内流水平。检测HC与SLE外周血B细胞在干预miR-7表达后BCR诱导的离子内流水平。荧光定量PCR(染色法)检测培养基对照.rIL-21.rCD40L+aIgM与rCD40L+algM+rIL-21孵育后HC与SLE患者B细胞中FOXO1、BLIMP1与AID的mRNA水平。流式细胞术检测IL-21孵育5天后HC与SLE患者外周血B细胞表面CD19、 CD27、CD38与CD138等分化标志,同时检测孵育后各组B细胞胞内PTEN的蛋白水平。流流式细胞术检测miR-7antagomir干预后IL-21孵育5天后HC与SLE患者外周血B细胞表面CD19、CD27、CD38与CD138等分化标志,与negative antagomir control相比较,同时检测孵育后各组B细胞胞内PTEN的蛋白水平。结果：2、IL-21单独刺激,并不引起HCB细胞Akt的磷酸化(ns),但可以引起SLE患者B细胞Akt磷酸化水平明显增高(p=0.008)。HC中同时以CD40L和anti-lgM作为刺激剂,可以诱导明显的Akt磷酸化(p<0.05),这种对于Akt磷酸化的调控可以被IL-21所逆转(p<0.05),SLE中CD40L+anti-IgM共刺激与HC组类似,加入后使Akt磷酸化水平明显上调(p=0.02),但IL-21对于共刺激组引起的升高的Akt磷酸化水平的负向调控作用存在缺陷(p>0.05)3、四种条件：培养基对照、rIL-21、rCD40L+aIgM与rCD40L+aIgM+rIL-21刺激下对SLE患者外周血B细胞内STAT3磷酸化的调控与HC一致,未见异常4、狼疮B细胞中静息状态[Ca2+]内流程度较HC明显增高(p=0.02)。另一方面,与HC B细胞相比,狼疮B细胞加入anti-IgM可以通过BCR刺激诱导B细胞产生更高水平的[Ca2+]i反应(p=0.001)。5、以miR-7的antagomir抑制胞内miR-7的表达,并不能认为对BCR引起的[Ca2+]i有明显的调控作用(p>0.05),但在SLE患者B细胞中,拮抗高表达的miR-7后,B细胞对于对BCR刺激的反应明显减弱,表现在于异常高水平[Ca2+]i出现明显的下调(p=0.0004)6、与HC相比,SLE患者外周血B细胞以培养基对照、rIL-21、rCD40L+aIgM与rCD40L+aIgM+rIL-21四组分别孵育后FOXO1、BLIMP1与AID等B细胞分化相关分子mRNA水平均存在异常。7、单加IL-21即可引起SLE患者B细胞明显向浆细胞水平分化,表现为CD27+CD38hi浆母细胞与CD138+CD38hi浆细胞比例明显增高(p值分别为0.02,0.01),以miR-7的antagomir人为下调miR-7的表达,可以逆转这种由IL-21引起的B细胞异常分化。8、在HC与SLE外周血B细胞中,人为控制miR-7的表达：加入miR-7的抑制剂antagomir或是其前体pre-miR-7,对于IL-21诱导的STAT3水平均无明显影响。结论：miRNAs,包括miR-21,22和7在内的表达增加可能会导致PTEN缺陷表达和BCR信号增强。这其中的两个miRNA, miR-7和22是由IL-21的调节,并在正常B细胞中以提供一个负反馈环路存在,可以限制BCR信号。在SLE的B细胞PTEN表达减少和他们的高反应性可以被miR-7的antagomir逆转,提示这个miRNA可能在狼疮B细胞的高活化状态上发挥主导作用。因此,由miR-7,或者是miR-21和22调控的降低的PTEN表达,对狼疮中B细胞的高反应性和B细胞的动态平衡受干扰有关。