米糠肽-铁锌螯合物的制备及消化吸收特性研究

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生物活性肽螯合微量元素作为一种新型的补充剂,凭借肽段的转运机制被机体消化吸收,具有耗能少、转运速度快、利用率高等优点,是目前研究的热点之一。米糠蛋白富含多种营养成分,是一种优质的谷物蛋白。米糠肽作为米糠蛋白的水解产物,具有降血压、调节免疫力等生物活性,但其金属结合能力尤为突出。以米糠为原料开发生物活性肽,制备具有调节人体生理功能的金属螯合肽,具有重要的意义。本文以米糠为原料,首先优化不同螯合因素对米糠肽-铁锌螯合物螯合率的影响,确定米糠肽-铁锌螯合物的最佳螯合工艺;其次对米糠肽进行分离纯化,分析其氨基酸序列,固相合成螯合活性高的肽段并进行分子动力学模拟,探究米糠肽-铁锌螯合物的螯合机制;在此基础上表征米糠肽-铁锌螯合物结构特性,并研究其在不同条件下的稳定性;最后通过模拟胃肠消化和Caco-2细胞模型探讨米糠肽-铁锌螯合物的消化吸收特性。主要内容及结果如下:(1)以米糠蛋白为原料,优化米糠肽-铁锌螯合物的制备条件。以水解度(DH)和亚铁离子与锌离子的螯合率为评价指标,考察蛋白酶种类、反应物质量比、温度、时间及p H对米糠肽-铁锌螯合物的影响。结果表明,碱性蛋白酶最适宜制备米糠肽,其最佳螯合工艺为时间70 min、温度70℃、反应物质量比3:1、p H 5.0。在此条件下的总螯合率达到95.49%,其中,亚铁离子的螯合率为38.29%、锌离子的螯合率为57.2%,与预测值接近。(2)采用离子交换色谱法和凝胶过滤层析法分离纯化米糠肽,收集螯合活性高的组分进行结构分析,共得到六条氨基酸序列,其中REELEKVFER、ASEEQVRELR和RDPKEELR的螯合活性最高,总螯合率分别为113.70%、124.86%和134.89%。将这三条肽段固相合成,通过分子动力学模拟探究REELEKVFER、ASEEQVRELR和RDPKEELR与亚铁离子、锌离子的螯合位点。结果表明,谷氨酸、精氨酸、丝氨酸和脯氨酸等参与亚铁离子和锌离子的配位并促进其结合。(3)采用硫化钠法、氨基酸组成分析验证螯合反应的进行,结果表明米糠肽与亚铁离子、锌离子发生螯合反应,其中氨基和羧基具有较好的铁锌螯合能力;紫外光谱分析(UV)和红外光谱分析(FTIR)结果表明,亚铁离子、锌离子主要通过氨基酸基团的羧基O原子和氨基N原子参与反应;荧光光谱分析证明米糠肽的生色基团与亚铁离子、锌离子发生螯合反应,导致荧光强度减弱,产生荧光淬灭现象;Zeta电位显示羧基是米糠肽的主要螯合位点;核磁共振氢谱(~1H NMR)谱图证明,羧基、氨基均参与了螯合反应;使用扫描电镜观察米糠肽-铁锌螯合物的微观结构,结果表明米糠肽与亚铁离子、锌离子反应形成表面粗糙不平且附有颗粒状晶体的米糠肽-铁锌螯合物,同时还伴有吸附作用的存在;稳定性分析表明,米糠肽-铁锌螯合物在中性或弱碱性环境下、低乙醇体积分数下、低浓度PBS溶液下保留率升高,稳定性增强,且温度的变化对其稳定性无显著性影响。(4)通过模拟胃肠消化探究米糠肽-铁锌螯合物的消化吸收特性,结果表明胃部消化后,亚铁离子和锌离子的保留率降低,稳定性减弱,而在肠部消化后其保留率升高,稳定性增强,有利于米糠肽-铁锌螯合物的吸收和利用;细胞研究表明,细胞培养至第21天时,细胞分化完成,完整性好,Caco-2单层细胞模型建立成功;采用双向跨膜转运研究分析米糠肽-铁锌螯合物的转运方式,结果证明米糠肽-铁锌螯合物的铁、锌转运量和生物利用率均强于无机亚铁盐、锌盐,补铁、补锌效果好,且铁、锌在AP侧的转运量是BL侧的2倍,AP侧的转运能力显著强于BL侧,可以促进米糠肽-铁锌螯合物在小肠中的吸收。此外,米糠肽-铁锌螯合物在Caco-2细胞上的转运方式以主动转运为主。
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