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前言hASHl (human achaete-scute homolog 1)基因是一个bHLH (basic helix-loop-helix)转录因子,首先从甲状腺髓样癌的cDNA文库中克隆出来,位于12q22-q23。在脊椎动物的发育过程中,ASH1基因通常只暂时性的表达于胚胎肺神经内分泌细胞的早期分化阶段,在终末分化标记物出现后其表达趋于沉默。已有研究表明在具有神经内分泌分化的前列腺癌、甲状腺髓样癌、胃肠道神经内分泌癌中有hASHl基因的表达。目前临床常用的非激素类神经内分泌肿瘤标志物有嗜铬粒蛋白A (chromogranin A, CgA)、突触素(synaptophysin, Syn)和CD56等。本实验通过免疫组织化学方法、Western blot和RT-PCR方法检测正常肺组织和各型肺肿瘤中hASHl基因的表达情况,分析其表达与神经内分泌标志物的相关性,探讨其成为更为特异和敏感的临床病理诊断肺神经内分泌肿瘤的标志物的可能性。材料和方法一、材料收集166例肺癌组织蜡块(鳞癌30例,腺癌30例,大细胞癌20例,典型类癌16例,非典型类癌20例,大细胞神经内分泌癌10例,小细胞癌40例),其中35例取自辽宁省肿瘤医院,其余取自中国医科大学附属一院,49例肺炎性假瘤及10例癌旁正常肺组织蜡块取自中国医科大学附属一院。23例肺癌新鲜组织标本(有相应的蜡块标本),9例鳞癌,9例腺癌和5例小细胞癌新鲜组织均取自中国医科大学附属一院2008年5月-2009年5月手术切除二、主要试剂和来源浓缩型兔抗人ASH1多克隆抗体(ab38557)购自Abcam公司,即用型鼠抗人chromogranin A单克隆抗体(MAB-0202)、鼠抗人synaptophysin单克隆抗体(MAB-0078)、鼠抗人CD56单克隆抗体(RAB-0256)均购自福州迈新生物技术公司。三、方法(一)免疫组织化学染色蜡块标本切片后按照链菌素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法(SP法)检测,所有标本均检测hASHl(1：100)蛋白,所有肺神经内分泌癌标本均检测CgA、Syn和CD56的表达情况,以磷酸缓冲液PBS代替一抗作为阴性对照。(二)Western blot从组织内提取细胞全蛋白,SDS-PAGE电泳,hASHl蛋白40V恒压4℃湿转100min,TBS／0.3%Tween-20／5%小牛血清室温封闭2hrs,一抗(1：500)4℃孵育过夜,辣根酶标记山羊抗兔二抗(1：5000)37℃孵育2h。内参β-actin在电泳后以切胶方式与hASHl蛋白所在部位分开转印。ECL显色,X线胶片曝光成像。(三)RT-PCR利用Trizol提取组织中总的RNA,经反转录成cDNA,hASHl的引物上游序列5’-TCCCCCAACTACTCCAACGAC-3’,下游序列是5’CCCTCCCAACGCCACTG-3’,以β-actin为内参照,循环条件为：94"C预变性5min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,30个循环后于72℃延伸5min,最后经琼脂糖凝胶电泳后保存图像。(四)统计学分析应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理,对hASHl在各种肺组织中表达的差异采用x2检验(n>40)或Fisher确切概率法(n<40)分析,采用Spearman等级相关分析hASHl与CgA、Syn、CD56表达的相关性,P<0.05为差异有统计学意义。结果一、免疫组织化学结果hASH1蛋白表达定位于细胞核,在正常肺组织、肺炎性假瘤、肺鳞癌、肺腺癌和肺大细胞癌中不表达；在典型类癌中的表达阳性率为12.5%(2／16),在非典型类癌中的表达阳性率为75%(15／20),差别有统计学意义(P<0.01)；在大细胞神经内分泌癌中的表达阳性率为60%(6／10),在小细胞癌中的表达阳性率为77.5%(31／40),差别无统计学意义(P>0.05)；CgA、Syn在细胞浆呈现棕黄色细小颗粒者为阳性染色,CD56在细胞膜和细胞浆呈现棕黄色细小颗粒者为阳性染色,36例类癌中,27例(75.0%)CgA阳性,26例(72.2%)Syn阳性,29例(80.6%)CD56阳性,在50例大细胞神经内分泌癌和小细胞癌中,24例(48.0%)CgA阳性,38例(76.0%)Syn阳,42例(84.0%)CD56阳性；hASH1的表达与CgA、Syn、CD56的表达存在相关性(P<0.05)。二、Western blot结果hASHl蛋白在肺鳞癌和腺癌组织中不表达,在小细胞肺癌组织中高表达。三、RT-PCR结果hASH1 mRNA在肺鳞癌和腺癌组织中不表达,在小细胞肺癌组织中高表达。结论hASHl基因的表达仅限于肺神经内分泌肿瘤中,对肺神经内分泌肿瘤具有高度的特异性和较高的敏感性,可能成为肺神经分泌肿瘤尤其是肺小细胞癌的临床病理诊断标志物。