研究背景:高强度聚焦超声(high-intensity focused ultrasound ,HIFU)作为肿瘤治疗的新技术引起了越来越多的关注。其工作原理是利用超声波穿透性、方向性、聚焦性好的特点,将体外低能量的超声聚焦于体内肿瘤组织,在焦点区域高能量的超声,通过高热效应较精确地杀死肿瘤细胞,而不损伤周围组织。由于一般HIFU的焦域较小,约为10×3×3 mm,因此整个肿瘤的治疗需要逐点和逐层的焦点扫描或分多次治疗来完成。当前,临床上HIFU治疗肿瘤普遍采用密集扫描的策略,其目的是为了产生密集排列的热变性区域(thermal lesions),以保证尽可能彻底地杀灭肿瘤细胞,预防肿瘤复发。但是临床实践表明,尽管采用这种密集扫描的治疗策略,仍不能完全杀灭肿瘤细胞,HIFU治疗后的原位复发率和转移率都相当高。我们的前期研究表明,HIFU能通过损伤肿瘤细胞诱生和局部释放多种内源性树突状细胞(DC)激活因子,刺激DC活化和成熟,进而诱导特异性抗肿瘤免疫应答。进一步的研究发现HIFU治疗后可以招募DC细胞向瘤内的热损伤部位聚集,而且DC主要聚集于热变性区域的周围区域。根据HIFU治疗时瘤内温度变化的分布曲线,该区域温度在HIFU处理的4秒内上升至55℃左右,低于焦域内的80℃。这提示受到不同程度HIFU热效应损伤的肿瘤细胞可能具有不同的刺激DC活化成熟和诱导抗肿瘤免疫的能力。基于这些研究结果,我们进一步推测,如果把现行的密集扫描策略改为采用稀疏的扫描策略,造成离散的热损伤灶,能保留对DCs成熟刺激能力更强的热损伤灶周围区域的肿瘤细胞,最终增强HIFU诱导的系统抗肿瘤免疫应答。研究目的:旨在通过优化HIFU的治疗参数和扫描策略来更有效的刺激DC成熟,从而增强HIFU诱导的抗肿瘤免疫作用,为进一步挖掘HIFU免疫调控的潜力指明方向。研究方法:采用上海爱申科技发展公司提供的高能量聚焦超声动物实验样机建立HIFU实验系统。建立两套不同的HIFU肿瘤治疗策略,其中一套采用密集扫描策略,以模拟传统HIFU治疗效应;另一套采用稀疏扫描策略,以保存每个热变性区域的周围组织。采用B16黑色素瘤和MC-38结肠腺癌C57BL/c小鼠模型。实验中将肿瘤细胞接种于小鼠右后肢皮下,待肿瘤直径长至8-10mm大小后进行HIFU治疗。荷瘤小鼠分别使用密集扫描或稀疏扫描策略进行HIFU治疗后,切除肿瘤,用免疫组织化学方法和流式细胞术检测HIFU治疗部位的DC浸润情况。为比较受到不同程度HIFU热效应损伤的肿瘤细胞是否具有不同的刺激DC成熟的能力,经不同HIFU处理的肿瘤细胞分别与未成熟的DC共孵育,检测共孵育细胞培养基上清中IL-12和IL-10的分泌量以及DC细胞表面CD80/CD86的表达水平。通过分析不同的HIFU治疗过的荷瘤小鼠脾脏的IFN-γ分泌细胞数以及对再次攻击肿瘤的生长阻滞作用,评估HIFU诱导的抗肿瘤免疫应答。结果:成功搭建荷瘤小鼠体内HIFU治疗和肿瘤细胞体外HIFU处理的实验系统。以MC-38小鼠结肠癌和B16黑色素瘤荷瘤小鼠为动物模型,对HIFU系统进行了治疗参数的校准,使其可以在肿瘤组织内产生与临床一致的热效应,单点HIFU治疗造成典型的热变性区域。分析了HIFU治疗后瘤内DC聚集的特点,发现HIFU治疗可以招引DC细胞向瘤内的热损伤部位聚集,而且DC主要聚集于热变性区域的周围区域,该区域温度在HIFU处理的4s内上升至55℃左右,低于焦域内的80℃。采用肿瘤细胞-DC共培养系统证明:HIFU处理的肿瘤细胞具有显著的刺激DC成熟的作用,而且55℃-HIFU处理的肿瘤细胞的DC刺激活性明显高于80℃-HIFU处理的肿瘤细胞。提供证据表明不同HIFU处理的肿瘤细胞刺激DC细胞成熟的作用机制与其诱导HMGB1释放和HSP70/HSP90向细胞膜转移有密切关系。体内实验证明稀疏扫描策略HIFU可以产生与密集扫描策略类似的对原发肿瘤的治疗效果,但其诱导的特异性抗肿瘤应答远远高于密集扫描策略HIFU。肿瘤再攻击实验发现采用稀疏扫描策略的HIFU治疗个体,抵御肿瘤再攻击的能力增强。进一步分析瘤内DC细胞的数目及其成熟状态,发现稀疏扫描策略HIFU能使肿瘤中浸润的DC比例及其CD80和CD86表达水平更高,表明其促进DC向肿瘤组织浸润并刺激DC成熟的作用比密集扫描策略更强。结论:优化HIFU的扫描策略,采用稀疏的扫描密度,有可能通过更有力地激活DC细胞的活化和成熟,诱导出更强的抗肿瘤免疫应答,从而杀灭残存的活细胞,同时防治肿瘤的远端转移。