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目前,以免疫治疗为代表的生物治疗已经成为继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗模式,成为近年来国际上研究的热点,其中,针对肿瘤抗原的靶向治疗以展示出良好的优势。在已知的众多肿瘤相关抗原中,癌睾丸抗原(cancer/testis antigen, CTA)有特异的表达模式,即在各种肿瘤组织中有不同频率的表达,而在正常组织中仅在睾丸生殖细胞中表达,偶在胎盘中表达。但睾丸是免疫豁免器官,不引起机体特异性免疫反应。因此,CTA适于作为特异性肿瘤免疫治疗的靶抗原。作为CTA亚家族的黑色素瘤抗原基因(melanoma antigen gene, MAGE)是从黑色素瘤细胞中分离出来的一大家族抗原基因。MAGE基因编码的肿瘤排斥抗原在细胞内被加工产生抗原肽,与HLA-I类分子结合形成复合物,能够被自体细胞毒性T细胞识别,诱导出对相应肿瘤细胞的特异性杀伤。因此,对MAGE的深入研究将会为肿瘤分子学诊断和肿瘤免疫治疗提供良好的实验基础。本研究采用免疫组织化学染色法检测了MAGE家族成员MAGE-A9、-A10、-A12在乳腺癌组织及相应癌旁正常乳腺组织中的表达,分析了其表达与乳腺癌临床生物学指标之间的相关性。采用MTT法分析及克隆形成实验检测了MAGE-A9对乳腺癌细胞增殖的影响。主要研究内容和结果如下:第一部分肿瘤抗原MAGE-A9、-A10、-A12在乳腺癌组织中的表达及与乳腺癌临床生物学指标之间的关系目的:通过检测MAGE-A9、-A10、-A12在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达,探讨其表达与乳腺癌临床生物学指标之间的关系。方法:应用免疫组织化学方法检测60例乳腺癌组织及16例相应癌旁正常乳腺组织中MAGE-A9、-A10、-A12的蛋白表达状况,并分析其表达与乳腺癌临床生物学指标之间的关系。结果:1在阳性对照的正常睾丸组织中,MAGE-A9主要在初级精母细胞和精原细胞中表达,且胞浆胞核都有表达。在乳腺癌组织中,MAGE-A9主要表达于细胞质,部分表达于细胞核。16例正常乳腺组织中未发现MAGE-A9的表达,60例乳腺癌组织有28例MAGE-A9蛋白表达阳性,阳性率为46.7%,提示MAGE-A9为肿瘤特异性抗原。在乳腺癌组织中,MAGE-A9蛋白表达阳性率随着C-erbB2和ER-β表达率的增加而增加(Z=-2.757,P=0.006)、(Z=-2.187,P=0.029)。MAGE-A9蛋白表达与乳腺癌患者的年龄(χ~2=0.804,P=0.370)、病理类型(χ~2=0.000,P=1.000)、组织学分级(Z=-0.935,P=0.350)、临床分期(χ~2=0.000,P=1.000)、肿瘤大小(χ~2=0.741,P=0.690)、淋巴转移(χ~2=0.268,P=0.605)、ER-α(Z=-0.746,P=0.455)、PR(Z=-0.031,P=0.975)及AIB-I(Z=-1.159,P=0.247)表达均无相关性。2在阳性对照的正常睾丸组织中,MAGE-A10主要在初级精母细胞和精原细胞中表达,且胞浆胞核都表达。在乳腺癌组织中,MAGE-A10主要定位于细胞质,部分定位于细胞核。16例正常乳腺组织中未发现MAGE-A10的表达,60例乳腺癌组织有44例MAGE-A10蛋白表达阳性,阳性率为73.33%,提示MAGE-A10为肿瘤特异性抗原。MAGE-A10蛋白表达与乳腺癌患者的年龄(χ~2=0.114,P=0.736)、病理类型(χ~2=0.809,P=0.368)、组织学分级(Z=-0.772,P=0.440)、临床分期(χ~2=1.378,P=0.241)、肿瘤大小(χ~2=0.861,P=0.650)、淋巴转移(χ~2=0.000,P=1.000)、ER-α(Z=-1.362,P=0.173)、C-erbB2(Z=-0.919,P=0.358)、ER-β(Z=-0.495,P=0.620)、PR(Z=-1.136,P=0.256)及AIB-I(Z=-0.563,P=0.574)表达均无相关性。3在阳性对照的正常睾丸组织中,MAGE-A12主要在初级精母细胞和精原细胞中表达,且胞浆胞核都有表达。在乳腺癌组织中,MAGE-A12主要表达于细胞质,部分表达于细胞核。16例乳腺正常组织中未发现MAGE-A12的表达,60例乳腺癌组织有56例MAGE-A12蛋白表达阳性,阳性率为93.33%,提示MAGE-A12为肿瘤特异性抗原。MAGE-A12蛋白表达与乳腺癌患者的年龄(χ~2=0.357,P=0.550)、病理类型(χ~2=1.702,P=0.192)、组织学分级(Z=-0.058,P=0.954)、临床分期(χ~2=0.000,P=1.000)、肿瘤大小(χ~2=0.117,P=0.943)、淋巴转移(χ~2=0.000,P=1.000)、ER-α(Z=-1.366,P=0.172)、C-erbB2(Z=-1.316,P=0.188)、ER-β(Z=-1.496,P=0.135)、PR(Z=-1.779,P=0.075)及AIB-I(Z=-0.322,P=0.748)表达均无相关性。4 60例乳腺癌组织标本中,MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A12蛋白表达呈不均匀分布。78.33%的标本至少表达一种上述的MAGE蛋白(47/60)。在60例乳腺癌标本中MAGE-A9、MAGE-A10蛋白同时表达的有25例,占41.67%(25/60),MAGE-A10、MAGE-A12蛋白同时表达的有21例,占35%(21/60),MAGE-A9、MAGE-A12蛋白同时表达的有15例,占25%(15/60)。三种蛋白同时表达的有4例,占23.33%(14/60)。60例乳腺癌组织中3种蛋白阳性表达率之间无明显差异(χ~2=0.000,P=1.000>0.05)。如上所述MAGE-A家族的表达具有聚集性。结论:1 MAGE-A9是一种肿瘤特异性抗原。2在乳腺癌组织中,MAGE-A9蛋白的表达率随着C-erbB2和ER-β表达率的增加而增加。推测,MAGE-A9有可能成为指导乳腺癌治疗及判断预后的一个重要参考指标。3 MAGE-A家族分子在乳腺癌中表达有聚集现象。第二部分MAGE-A9对乳腺癌细胞增殖的影响目的:研究MAGE-A9对乳腺癌细胞增殖的影响。方法:通过细胞培养、基因转染、RT-PCR、Western-blot方法检测乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231中MAGE-A9和C-erbB2的表达情况;通过MTT法及克隆形成实验研究MAGE-A9对细胞增殖的影响;用免疫共沉淀法检测MAGE-A9和C-erbB2蛋白的相互作用。结果:1 MCF-7和MDA-MB-231细胞中,MAGE-A9和C-erbB2在基因转录水平上表达均为阳性,并且C-erbB2在MDA-MB-231细胞中的表达水平弱于在MCF-7细胞中的表达。2 MCF-7和MDA-MB-231细胞中,MAGE-A9在蛋白水平表达均为阴性;C-erbB2表达均为阳性,且C-erbB2在MDA-MB-231细胞中的表达水平弱于在MCF-7细胞中的表达。3将MAGE-A9基因转染MCF-7细胞,体外培养48h后,细胞的增殖率与转染空载体对照组相比显著增加(P<0.05)。4克隆形成实验结果显示,转染MAGE-A9基因,并经G418筛选两周后,MCF-7细胞克隆形成数为463±53.5,明显高于转染空载体的对照组117±2.3 (P<0.05)。5 MAGE-A9与C-erbB2分子之间无直接蛋白相互作用。结论:1外源性MAGE-A9可促进MCF-7细胞增殖,2 MAGE-A9对MCF-7细胞的促增殖作用可能不是通过与C-erbB2分子直接的蛋白相互作用实现的。