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背景和目的：
慢性乙型肝炎相关肝癌发病率及病死率逐年上升。目前肝癌发病机制虽有多种假说，但确切机制至今尚未明确是其妨碍提高防治水平的关键科学问题。多年来防治肝癌的策略主要集中于抗病毒和肝癌细胞本身，忽略了人体内在宿主因素的影响。随着肝癌微环境概念的提出，其作为影响肝癌发生发展的关键因素，逐渐引起研究者的重视。慢性肝病的肝脏炎症和纤维化形成的异常肝再生微环境促进肝癌的发生发展。因此研究通过改善肝再生微环境降低肝癌发生，抑制其进展及转移，具有极大的临床参考价值和深远的科学意义。本文结合临床试验和体外实验两部分，旨在探讨地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用及机制：第一部分，观察地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生率及发生风险的影响。第二部分，揭示共培养条件下TGF-β1活化肝星状细胞LX2与EMT/MET失衡的相关机制，分析其对肝癌细胞HCCLM3增殖、凋亡和侵袭能力的影响，探讨地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境、调控EMT/MET失衡和TGF-β/Smad信号通路紊乱以防治肝癌发生发展的机制。
方法：
1.本试验通过对前期完成的针对HBeAg阴性慢乙肝的随机对照临床试验（中国临床试验注册中心注册号：ChiCTR-TRC-12002962）的单用地五养肝胶囊或单用恩替卡韦或二者联用治疗时间达到48周的患者，进行长达108月前瞻性随访观察（恩替卡韦随访期间不停药），每6个月检测患者血常规、肝肾功能、凝血功能、乙肝两对半定量、血清HBV DNA水平和甲胎蛋白（AFP）。主要观察评价指标：观察随访期间终点事件肝癌的发生率。次要观察指标：观察随访期间慢乙肝患者生化学及病毒学应答。其中，肝癌累积发病率采用使用乘积限法（Kaplan-Meier）统计，并通过时序检验（log-rank）方法进行比较。
2.体外实验通过建立TGF-β1诱导激活的人肝星状细胞LX-2与人肝癌细胞株HCCLM3的共培养模型，模拟肝癌的肝再生微环境。实验分为LX2对照组（LX2-NS）、共培养模型组（Co-culture model）、共培养DWYG组（Co-culture DWYG），并给予地五养肝胶囊含药血清进行干预，通过CCK-8、流式细胞术、Transwell侵袭实验等细胞生物学方法观察共培养条件下活化人肝星状细胞LX2对肝癌细胞HCCLM3增殖、凋亡、侵袭能力的影响，通过Western Blotting、qRT-PCR等分子生物学方法研究共培养条件下活化人肝星状细胞LX2与EMT/MET失衡的机制，分析这一过程中TGF-β/Smad信号通路的Smad2、Smad3、TβRI、Smad7等mRNA和蛋白表达规律，探讨地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境、调控EMT/MET失衡和TGF-β/Smad信号通路紊乱以防治肝癌发生发展的机制。
结果:
（1）入组基线资料及随访时间比较：对符合纳入标准的170例患者随机分为三组，其中A组为地五养肝胶囊治疗组（56例），口服地五养肝胶囊；B组为地五养肝胶囊联合恩替卡韦治疗组（57例），同时应用地五养肝胶囊和恩替卡韦；C组为恩替卡韦对照组（57例），口服恩替卡韦，对治疗周期达到48周的患者进行108月随访。入组时各组患者在年龄、性别、血常规（包括中性粒细胞NEU、淋巴细胞LYM、中性粒细胞与淋巴细胞比值NLR以及血小板计数PLT）、PT国际标准化比值INR、肝功能包括（ALT、AST、GGT、ALB、TP、TBIL）及血清HBV-DNA水平无显著性差异(P>0.05)。随访从2012年1月1日至2021年1月11日，共随访108个月，平均随访时间84.03个月，中位随访时间94.00个月。地五养肝胶囊组的平均随访时间和中位随访时间分别为90.75个月、99.00个月，地五养肝胶囊联合恩替卡韦组的平均随访时间和中位随访时间分别为78.82个月、92.50个月，恩替卡韦组的的平均随访时间和中位随访时间分别为82.78个月、91.00个月。共计随访患者151例，总计失访率为11.18%（19/170）。其中，地五养肝胶囊组完成随访48例，地五养肝胶囊联合恩替卡韦组完成随访50例，恩替卡韦组完成随访53例，三组失访率依次为14.29%(8/56)、12.28%(7/57)、7.02%(4/57)，失访率组间比较无显著差异（P>0.05）。
（2）地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者生化学应答的比较：将不同干预方案的三组患者血生化结果进行分析，发现三组组间比较， ALT、AST水平无明显差异（P>0.05）。其他相关ALP、TP、ALB、GELO、TBIL、DBIL、IBIL等生化指标，在三组间比较差异不显著（P>0.05）。三组随访患者血生化指标分别与入组时相比，发现三组随访患者肝功能ALT、AST均较前下降（ALT：23.50±15.40 vs34.70±17.51，25.96±27.45 vs35.87±18.07，28.18±20.30 vs40.25±21.20；AST：22.08±5.87 vs28.72±11.24，23.11±11.17 vs31.91±11.61，27.57±16.85 vs33.72±14.35），差异具有统计学意义（P＜0.01），而ALP、TP、ALB、GELO、TBIL、DBIL、IBIL等生化指标，较前入组时相比无明显差异（P>0.05）。
（3）地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者病毒学应答的比较：不同治疗方案的各组患者HBV DNA水平均较入组时明显下降（P＜0.05）。HBV DNA水平在随访的三组间组间差异无统计学意义（P>0.05）。各组HBsAg水平分别与入组时相比，三组HBsAg水平较前明显降低（P＜0.05）。随访结果显示，三组患者中HBsAg下降>1500 IU/ml依次为34.21%(13/38)、35.71%(10/28)、28.57%(8/28)，经统计学分析三者差异无意义（P>0.05）。
（4）地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝癌累积发病率影响：随访至108月，采用Kaplan-Meier（乘积限法）法绘制肝癌发病生存曲线，并计算地五养肝胶囊组、地五养肝胶囊联合恩替卡韦组、恩替卡韦组随访发生肝癌事件的累积发病率依次为0%（0/48）、2%（1/50）、11.32%（6/53），然后采用时序检验LogRank(Mantel-Cox)进行分析检验，结果显示：三组患者肝癌累积发病率具有差异（P＜0.05）。其中，地五养肝胶囊组肝癌累积发病率（0%）明显低于恩替卡韦阳性对照组（11.32%）（P＜0.05）。地五养肝胶囊联合恩替卡韦组肝癌累积发病率（2%）低于恩替卡韦阳性对照组（11.32%）（P＜0.05）。地五养肝胶囊组肝癌发病率（0%）低于地五养肝胶囊联合恩替卡韦组肝癌发病率（2%），但差异无统计学意义（P>0.05）。提示相对于单独应用恩替卡韦抗病毒治疗，单用地五养肝胶囊或联合应用恩替卡韦均可显著降低HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝癌发病率。
（5）TGF-β1诱导LX2活化以及LX2/HCCLM3共培养体系中LX2的形态学观察：LX2活化前形体不规则呈多边星形，胞突生长不发达，细胞间连接紧密；经TGF-β1（10ng/ml）诱导激活后，细胞体积增大，胞突伸展，细胞间连接疏松，细胞增殖速度加快；与人肝癌细胞HCCLM3共培养后LX2胞伪足更加伸展，呈拉伸状两极生长，细胞增殖明显增快。
（6）筛选DWYG含药血清最佳给药浓度:采用CCK-8法检测不同浓度DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3增殖能力的影响。实验结果显示：与对照组相比，随着5%、10%、15%、20%等不同含药血清浓度的升高，各组细胞测得的A450值逐渐下降，HCCLM3细胞增殖活力明显下降（P＜0.01），细胞增殖抑制率逐渐增高（P＜0.01），选取10%为最佳实验用血清含药浓度。
结论：（1）根据170例地五养肝胶囊治疗HBeAg阴性慢性乙型肝炎RCT临床试验资料，随访至108月，单用地五养肝胶囊组与单用恩替卡韦组和联合用药组在生化学应答、病毒学应答方面疗效相当。单用地五养肝胶囊或者联用恩替卡韦能显著降低肝癌发病率。（2）构建的活化的 LX2与HCCLM3共培养体系模拟的肝癌肝再生微环境可促进 LX2和 HCCLM3增殖活力，抑制LX2和HCCLM3凋亡，增强HCCLM3细胞侵袭能力，其机制可能通过激活TGF-β/Smad信号通路促进EMT。DWYG含药血清能显著抑制共培养体系中的LX2和HCCLM3增殖，促进LX2和HCCLM3凋亡，降低HCCLM3细胞侵袭能力，其机制可能是通过抑制TGF-β/Smad信号通路过度激活、调节EMT/MET失衡，改善肝癌肝再生微环境，发挥防治肝癌发生发展的作用。
慢性乙型肝炎相关肝癌发病率及病死率逐年上升。目前肝癌发病机制虽有多种假说，但确切机制至今尚未明确是其妨碍提高防治水平的关键科学问题。多年来防治肝癌的策略主要集中于抗病毒和肝癌细胞本身，忽略了人体内在宿主因素的影响。随着肝癌微环境概念的提出，其作为影响肝癌发生发展的关键因素，逐渐引起研究者的重视。慢性肝病的肝脏炎症和纤维化形成的异常肝再生微环境促进肝癌的发生发展。因此研究通过改善肝再生微环境降低肝癌发生，抑制其进展及转移，具有极大的临床参考价值和深远的科学意义。本文结合临床试验和体外实验两部分，旨在探讨地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境降低HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生风险的作用及机制：第一部分，观察地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢乙肝患者肝癌发生率及发生风险的影响。第二部分，揭示共培养条件下TGF-β1活化肝星状细胞LX2与EMT/MET失衡的相关机制，分析其对肝癌细胞HCCLM3增殖、凋亡和侵袭能力的影响，探讨地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境、调控EMT/MET失衡和TGF-β/Smad信号通路紊乱以防治肝癌发生发展的机制。
方法：
1.本试验通过对前期完成的针对HBeAg阴性慢乙肝的随机对照临床试验（中国临床试验注册中心注册号：ChiCTR-TRC-12002962）的单用地五养肝胶囊或单用恩替卡韦或二者联用治疗时间达到48周的患者，进行长达108月前瞻性随访观察（恩替卡韦随访期间不停药），每6个月检测患者血常规、肝肾功能、凝血功能、乙肝两对半定量、血清HBV DNA水平和甲胎蛋白（AFP）。主要观察评价指标：观察随访期间终点事件肝癌的发生率。次要观察指标：观察随访期间慢乙肝患者生化学及病毒学应答。其中，肝癌累积发病率采用使用乘积限法（Kaplan-Meier）统计，并通过时序检验（log-rank）方法进行比较。
2.体外实验通过建立TGF-β1诱导激活的人肝星状细胞LX-2与人肝癌细胞株HCCLM3的共培养模型，模拟肝癌的肝再生微环境。实验分为LX2对照组（LX2-NS）、共培养模型组（Co-culture model）、共培养DWYG组（Co-culture DWYG），并给予地五养肝胶囊含药血清进行干预，通过CCK-8、流式细胞术、Transwell侵袭实验等细胞生物学方法观察共培养条件下活化人肝星状细胞LX2对肝癌细胞HCCLM3增殖、凋亡、侵袭能力的影响，通过Western Blotting、qRT-PCR等分子生物学方法研究共培养条件下活化人肝星状细胞LX2与EMT/MET失衡的机制，分析这一过程中TGF-β/Smad信号通路的Smad2、Smad3、TβRI、Smad7等mRNA和蛋白表达规律，探讨地五养肝胶囊通过改善肝再生微环境、调控EMT/MET失衡和TGF-β/Smad信号通路紊乱以防治肝癌发生发展的机制。
结果:
（1）入组基线资料及随访时间比较：对符合纳入标准的170例患者随机分为三组，其中A组为地五养肝胶囊治疗组（56例），口服地五养肝胶囊；B组为地五养肝胶囊联合恩替卡韦治疗组（57例），同时应用地五养肝胶囊和恩替卡韦；C组为恩替卡韦对照组（57例），口服恩替卡韦，对治疗周期达到48周的患者进行108月随访。入组时各组患者在年龄、性别、血常规（包括中性粒细胞NEU、淋巴细胞LYM、中性粒细胞与淋巴细胞比值NLR以及血小板计数PLT）、PT国际标准化比值INR、肝功能包括（ALT、AST、GGT、ALB、TP、TBIL）及血清HBV-DNA水平无显著性差异(P>0.05)。随访从2012年1月1日至2021年1月11日，共随访108个月，平均随访时间84.03个月，中位随访时间94.00个月。地五养肝胶囊组的平均随访时间和中位随访时间分别为90.75个月、99.00个月，地五养肝胶囊联合恩替卡韦组的平均随访时间和中位随访时间分别为78.82个月、92.50个月，恩替卡韦组的的平均随访时间和中位随访时间分别为82.78个月、91.00个月。共计随访患者151例，总计失访率为11.18%（19/170）。其中，地五养肝胶囊组完成随访48例，地五养肝胶囊联合恩替卡韦组完成随访50例，恩替卡韦组完成随访53例，三组失访率依次为14.29%(8/56)、12.28%(7/57)、7.02%(4/57)，失访率组间比较无显著差异（P>0.05）。
（2）地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者生化学应答的比较：将不同干预方案的三组患者血生化结果进行分析，发现三组组间比较， ALT、AST水平无明显差异（P>0.05）。其他相关ALP、TP、ALB、GELO、TBIL、DBIL、IBIL等生化指标，在三组间比较差异不显著（P>0.05）。三组随访患者血生化指标分别与入组时相比，发现三组随访患者肝功能ALT、AST均较前下降（ALT：23.50±15.40 vs34.70±17.51，25.96±27.45 vs35.87±18.07，28.18±20.30 vs40.25±21.20；AST：22.08±5.87 vs28.72±11.24，23.11±11.17 vs31.91±11.61，27.57±16.85 vs33.72±14.35），差异具有统计学意义（P＜0.01），而ALP、TP、ALB、GELO、TBIL、DBIL、IBIL等生化指标，较前入组时相比无明显差异（P>0.05）。
（3）地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者病毒学应答的比较：不同治疗方案的各组患者HBV DNA水平均较入组时明显下降（P＜0.05）。HBV DNA水平在随访的三组间组间差异无统计学意义（P>0.05）。各组HBsAg水平分别与入组时相比，三组HBsAg水平较前明显降低（P＜0.05）。随访结果显示，三组患者中HBsAg下降>1500 IU/ml依次为34.21%(13/38)、35.71%(10/28)、28.57%(8/28)，经统计学分析三者差异无意义（P>0.05）。
（4）地五养肝胶囊对HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝癌累积发病率影响：随访至108月，采用Kaplan-Meier（乘积限法）法绘制肝癌发病生存曲线，并计算地五养肝胶囊组、地五养肝胶囊联合恩替卡韦组、恩替卡韦组随访发生肝癌事件的累积发病率依次为0%（0/48）、2%（1/50）、11.32%（6/53），然后采用时序检验LogRank(Mantel-Cox)进行分析检验，结果显示：三组患者肝癌累积发病率具有差异（P＜0.05）。其中，地五养肝胶囊组肝癌累积发病率（0%）明显低于恩替卡韦阳性对照组（11.32%）（P＜0.05）。地五养肝胶囊联合恩替卡韦组肝癌累积发病率（2%）低于恩替卡韦阳性对照组（11.32%）（P＜0.05）。地五养肝胶囊组肝癌发病率（0%）低于地五养肝胶囊联合恩替卡韦组肝癌发病率（2%），但差异无统计学意义（P>0.05）。提示相对于单独应用恩替卡韦抗病毒治疗，单用地五养肝胶囊或联合应用恩替卡韦均可显著降低HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者肝癌发病率。
（5）TGF-β1诱导LX2活化以及LX2/HCCLM3共培养体系中LX2的形态学观察：LX2活化前形体不规则呈多边星形，胞突生长不发达，细胞间连接紧密；经TGF-β1（10ng/ml）诱导激活后，细胞体积增大，胞突伸展，细胞间连接疏松，细胞增殖速度加快；与人肝癌细胞HCCLM3共培养后LX2胞伪足更加伸展，呈拉伸状两极生长，细胞增殖明显增快。
（6）筛选DWYG含药血清最佳给药浓度:采用CCK-8法检测不同浓度DWYG含药血清对LX2/HCCLM3共培养体系中HCCLM3增殖能力的影响。实验结果显示：与对照组相比，随着5%、10%、15%、20%等不同含药血清浓度的升高，各组细胞测得的A450值逐渐下降，HCCLM3细胞增殖活力明显下降（P＜0.01），细胞增殖抑制率逐渐增高（P＜0.01），选取10%为最佳实验用血清含药浓度。
结论：（1）根据170例地五养肝胶囊治疗HBeAg阴性慢性乙型肝炎RCT临床试验资料，随访至108月，单用地五养肝胶囊组与单用恩替卡韦组和联合用药组在生化学应答、病毒学应答方面疗效相当。单用地五养肝胶囊或者联用恩替卡韦能显著降低肝癌发病率。（2）构建的活化的 LX2与HCCLM3共培养体系模拟的肝癌肝再生微环境可促进 LX2和 HCCLM3增殖活力，抑制LX2和HCCLM3凋亡，增强HCCLM3细胞侵袭能力，其机制可能通过激活TGF-β/Smad信号通路促进EMT。DWYG含药血清能显著抑制共培养体系中的LX2和HCCLM3增殖，促进LX2和HCCLM3凋亡，降低HCCLM3细胞侵袭能力，其机制可能是通过抑制TGF-β/Smad信号通路过度激活、调节EMT/MET失衡，改善肝癌肝再生微环境，发挥防治肝癌发生发展的作用。