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本研究通过蛋白质组学方法对已获得的国庆1号温州蜜柑(G1)+HB柚二倍体胞质杂种以及其亲本G1和HB柚的叶片总蛋白进行比较研究,对差异表达蛋白点进行鉴定,探讨这些蛋白对二倍体胞质杂种可能产生的影响,期望预测二倍体胞质杂种在生长、发育、抗性等方面的表现,为柑橘胞质杂种后代作为育种资源利用提供理论依据。
本研究以柑橘叶片为材料,首先优化了柑橘叶片总蛋白质的提取方法;在此基础上,通过双向电泳研究柑橘二倍体胞质杂种及其亲本叶片中蛋白质的差异表达,并对差异点用MALDI-TOF/TOF进行鉴定。
本文主要结论如下:
1.采用传统的三氯乙酸(TCA)法、酚提法以及TCA与酚结合的方法提取柑橘叶片总蛋白质,通过目测可以发现,经TCA法和酚提法提取的蛋白质块呈黄色和墨绿色,受杂质污染严重,而用两种方法结合提取的蛋白质块为白色,污染小。通过SDS-PAGE电泳检测也发现通过结合法得到的蛋白质条带数比TCA法和酚提法获得的条带数多,背景更清晰。因此,本研究采用混合法进行柑橘叶片总蛋白质的提取。
2.利用双向电泳体系进行柑橘二倍体胞质杂种及其亲本叶片蛋白质点的比较,采用PD-Quest软件对电泳图谱进行分析发现,在p<0.01的水平上,G1+HB与G1柚之间90个点差异显著,G1+HB柚与HB柚之间20个点差异显著,G1与HB柚之间116个点差异显著,与本实验通过SSR、cpSSR、CAPS分子标记鉴定的结果相吻合。
3.定量分析中,杂种后代与HB柚相比,59个蛋白点表达量具有两倍以上的差异,其中30个点上调表达,29个点下调表达;杂种后代与G1相比,66个蛋白点表达量具有两倍以上的差异,其中31个点上调表达,35个点下调表达。
4.两倍差异表达的125个蛋白中,选取88个相对丰度较高的蛋白用MALDI-TOF/TOF质谱进行了鉴定,最终得到了35个蛋白质点的可信鉴定结果,它们代表25种不同的蛋白质。主要为与代谢相关的蛋白质(24％)、与光合作用相关的蛋白质(20％)、与胁迫相关的蛋白质(20％)、与抗氧化相关的蛋白质(16％)、其它蛋白(8％)以及一些未知功能的蛋白(12％)。
本研究以柑橘叶片为材料,首先优化了柑橘叶片总蛋白质的提取方法;在此基础上,通过双向电泳研究柑橘二倍体胞质杂种及其亲本叶片中蛋白质的差异表达,并对差异点用MALDI-TOF/TOF进行鉴定。
本文主要结论如下:
1.采用传统的三氯乙酸(TCA)法、酚提法以及TCA与酚结合的方法提取柑橘叶片总蛋白质,通过目测可以发现,经TCA法和酚提法提取的蛋白质块呈黄色和墨绿色,受杂质污染严重,而用两种方法结合提取的蛋白质块为白色,污染小。通过SDS-PAGE电泳检测也发现通过结合法得到的蛋白质条带数比TCA法和酚提法获得的条带数多,背景更清晰。因此,本研究采用混合法进行柑橘叶片总蛋白质的提取。
2.利用双向电泳体系进行柑橘二倍体胞质杂种及其亲本叶片蛋白质点的比较,采用PD-Quest软件对电泳图谱进行分析发现,在p<0.01的水平上,G1+HB与G1柚之间90个点差异显著,G1+HB柚与HB柚之间20个点差异显著,G1与HB柚之间116个点差异显著,与本实验通过SSR、cpSSR、CAPS分子标记鉴定的结果相吻合。
3.定量分析中,杂种后代与HB柚相比,59个蛋白点表达量具有两倍以上的差异,其中30个点上调表达,29个点下调表达;杂种后代与G1相比,66个蛋白点表达量具有两倍以上的差异,其中31个点上调表达,35个点下调表达。
4.两倍差异表达的125个蛋白中,选取88个相对丰度较高的蛋白用MALDI-TOF/TOF质谱进行了鉴定,最终得到了35个蛋白质点的可信鉴定结果,它们代表25种不同的蛋白质。主要为与代谢相关的蛋白质(24％)、与光合作用相关的蛋白质(20％)、与胁迫相关的蛋白质(20％)、与抗氧化相关的蛋白质(16％)、其它蛋白(8％)以及一些未知功能的蛋白(12％)。