在植物抗病毒基因工程领域中,利用植物病毒本身的基因或核苷酸序列整合到植物基因组中,能够获得稳定遗传的抗病植株,这样可以克服采用常规的自然选育抗病品系的困难,这种利用基因工程的方法已经成为抗病毒研究的一种有效的手段。随着植物抗病毒研究的不断发展,RNA介导的植物抗性引起研究者的广泛关注,RNA介导的植物抗性是植物进化过程中一种古老而且保守的抗病机制,它主要是通过形成dsRNA,进而启动植物体内转录后基因沉默(post-transcriptional genesilencing,PTGS)体系,使目的基因mRNA发生降解,不能正常的完成翻译过程。本研究以烟草、拟南芥、番木瓜作为转化材料,利用农杆菌介导法将含有报告基因GFP的载体pGA-GFP以及CP反向重复表达载体pHellsgate8-CPIR、pHellsgate12-CPIR导入到受体材料中,主要研究结果如下:
　　(1)pHellsgate12-CPIR表达载体转化烟草共获得120株抗性苗,用CP基因两端特异性引物P5(+),P4(-)进行PCR扩增。随机挑选了90株进行检测,其中有26株扩增出与预期目的基因一致的条带,阳性率占28.9％。用CP的正向引物P5(+)与其中一个内含子PDK的负向引物PDK(-)可以扩增总长约1700的片段,随机选取5株已经扩增出CP的pHellsgate12-CPIR植株进行检测,检测结果发现均能扩增出与阳性对照一致的条带。从PCR初步鉴定为阳性的pHellsgate12-CPIR转基因烟草中选取其中的7株进行Southern杂交检测,以碱性磷酸酶直接标记CP全长基因861bp作为杂交探针,7个转基因株系中都观察到杂交信号,进一步说明目的基因已整合到烟草基因组中。用Trizol提取pHellsgate12-CPIR转基因植物的总RNA,使用α-32p标记的CP作为探针进行杂交,仅在含有PRSV番木瓜病样中检测到CP mRNA的表达,转基因及对照中均没有检测到CP mRNA的表达。采用摩擦接种法对所得的26株pHellsgate12-CPIR转基因烟草接种番木瓜环斑病毒,接种后6周观察结果:7株转基因植株在植物整个发育期没有任何明显的症状,发育正常,即转基因植株对PRSV有一定抗病性。4株转基因植株形成大小不一的枯斑,直径约为0.2~1.0cm。15株转基因植株与非转基因对照发病症状类似,叶片出现大面积黄化,8周后病症处严重坏死。
　　(2)表达载体pGA-GFP转化烟草得到5株抗性苗,用GFP两端的特异引物G20,G21进行PCR扩增,仅一株扩增到目的带750bp,阳性率占20％,但未观察到荧光表达。
　　(3)pHellsgate8-CPIR表达载体转化烟草共获得70株抗性苗,有待于进一步进行分子检测。
　　(4)pHellsgate8-CPIR表达载体转化拟南芥,对拟南芥T1代种子进行筛选,具有抗性的转化植株能够在含有50mg/L kan的培养基上正常生长,叶片较绿,根系发达,而不具有抗性的阴性植株虽然也能够发芽,但是随后就会逐渐黄化枯死。筛选获得的抗性植株有待进一步进行分子检测。