论文部分内容阅读
第一部分Oncomine数据库中LGR5 mRNA在卵巢癌组织中的表达目的:Oncomine（www.oncomine.org）数据库中查阅LGR5 mRNA在卵巢癌组织中的表达情况,为进一步研究LGR5对EOC进展的作用及其作用机制奠定基础。方法:查阅 Oncomine（www.oncomine.org）数据库中,LGR5 mRNA 在卵巢癌组织中的表达情况,并整理出相关的数据。结果:（1）与正常卵巢组织相比,LGR5mRNA在卵巢癌中表达增高。（2）LGR5 mRNA的表达水平在Grade2-3的卵巢癌中升高。（3）LGR5 mRNA在Ⅲ或Ⅳ期卵巢癌中表达增高。结论:Oncomine数据库数据表明LGR5 mRNA在卵巢癌中高表达。第二部分LGR5在上皮性卵巢癌组织及细胞系中的表达目的:验证LGR5蛋白在上皮性卵巢癌细胞系和组织中的表达水平,分析其与临床病理特征的相关性,为进一步研究LGR5在上皮性卵巢癌中的作用及其作用机制奠定基础。方法:采用免疫组织化学方法检测上皮性卵巢癌组织切片中LGR5蛋白的表达情况;通过应用Western blot和RT-PCR检测LGR5在人上皮性卵巢癌细胞系SKOV3,HEY,HO8910以及人永生化卵巢上皮细胞系Moody中的表达水平。结果:（1）在上皮性卵巢癌组织中LGR5的表达水平显著高于正常卵巢组织。（2）LGR5表达情况与患者的年龄（P=0.026）和卵巢癌的病理类型（P＜0.001）相关,并且和转移呈正相关（p=0.025）,（3）在所检测分析的3种上皮性卵巢癌细胞系HEY、SKOV3、HO8910中LGR5的mRNA和蛋白水平均高于人永生化卵巢上皮细胞系Moody。结论:LGR5在上皮性卵巢癌组织及细胞系中的表达升高。第三部分LGR5可增强上皮性卵巢癌细胞的增殖和侵袭转移能力目的:通过体外实验验证LGR5对上皮性卵巢癌细胞增殖和侵袭转移能力的影响,探讨LGR5在上皮性卵巢癌发生发展过程中的作用。方法:通过稳定转染特异性siRNA下调上皮性卵巢癌细胞系SKOV3和HEY中LGR5的表达水平,通过稳定转染LGR5过表达质粒上调上皮性卵巢癌细胞HO8910中LGR5的表达水平。应用CCK-8实验和平板克隆形成实验检测LGR5表达水平的改变对上皮性卵巢癌细胞增殖能力的影响;应用Transwell细胞迁移实验,划痕实验,检测改变LGR5表达水平前后对上皮性卵巢癌细胞侵袭转移移能力的影响。结果:（1）CCK8实验结果表明与对照组相比下调LGR5的表达水平可抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖能力。（2）Transwell细胞迁移实验,划痕实验结果表明下调LGR5的表达水平可减弱上皮性卵巢癌细胞的侵袭转移能力。结论:LGR5可增强上皮性卵巢癌细胞的增殖和侵袭转移能力。第四部分 LGR5可诱导上皮性卵巢癌上皮间质转化的发生目的:探究LGR5在上皮性卵巢癌上皮间质转化（EMT）过程中的作用,为探讨LGR5增强上皮性卵巢癌侵袭转移能力的作用机制奠定基础。方法:应用Western blot检测LGR5表达水平的改变对EMT相关蛋白,如上皮性标志蛋白E-cadherin,间质性标志蛋白N-cadherin,Vimentin以及EMT相关转录因子Snail的表达量的影响。结果:（1）下调LGR5的表达后可降低间质性标志蛋白N-cadherin,Vimentin和EMT相关转录因子的表达水平,上调上皮性标志蛋白E-cadherin的表达水平。（2）上调LGR5的表达后可上调间质性标志蛋白N-cadherin,Vimentin和EMT相关转录因子的表达水平,同时降低上皮性标志蛋白E-cadherin的表达水平。结论:LGR5可诱导上皮性卵巢癌上皮间质转化的发生。第五部分LGR5可调控上皮性卵巢癌中Notch1通路目的:探讨LGR5在上皮性卵巢癌中与Notch1通路的关系,进一步探讨LGR5影响上皮性卵巢癌进展的作用机制。方法:在上皮性卵巢癌细胞系SKOV3和HO8910中下调或过表达LGR5后,应用Western blot检测LGR5对Notch1及其下游靶基因HES1表达的影响;为了深入探讨LGR5与Notch1信号通路之间的关系,在HO8910中应用Notch1通路抑制剂DAPT后,通过Western blot检测分析。结果:（1）在SKOV3中敲减LGR5后,Notch1及其下游靶基因HES1的表达水平下降,过表达LGR5以后结果则相反。（2）在HO8910中过表达LGR5后,可激活Notch1通路,DAPT可抑制由LGR5过表达所导致的Notch1通路活性的增高。结论:LGR5可调控上皮性卵巢癌中Notch1通路。第六部分降低LGR5的表达水平可减弱上皮性卵巢癌细胞的体内成瘤能力目的:通过裸鼠皮下成瘤实验,全面探讨LGR5对上皮性卵巢癌进展的影响。方法:在裸鼠皮下注射正常对照组及敲减LGR5后的SKOV3细胞后,待瘤体长出后测量皮下瘤的体积和重量。结果:（1）LGR5敲减后的上皮性卵巢癌细胞SKOV3在裸鼠皮下形成的肿瘤在体积与重量方面均小于对照组。因此,在体内LGR5可促进上皮性卵巢癌细胞的增殖。结论:降低LGR5的表达水平可减弱上皮性卵巢癌细胞的体内成瘤能力。