第一部分Sperm-Associated Antigen 6 (Spag6)基因敲除致小鼠内耳极性缺陷和听力损失目的Sperm-Associated Antigen 6 (Spag6)基因编码中心微管蛋白,对纤毛和鞭毛的运动十分重要。最近研究发现,Spag6对纤毛的发生、调节纤毛小根的排列方向和细胞的平面极性十分重要。内耳听觉上皮具有听觉形成所需要的独特结构,呈现最典型的平面极性,然而,Spag6在内耳是否有作用目前尚未见报道。本研究使用Spag6基因敲除小鼠探究Spag6在小鼠内耳中的作用。方法1.听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)和耳蜗微音电位(cochlear microphonics, CM)分别检测同窝Spag6+/+和Spag6-/小鼠的听力。ABR使用click声和短纯音分别进行刺激；CM使用click声进行刺激,记录结果。2.对内耳基底膜进行铺片及免疫荧光染色,显示毛细胞表皮板下的微管系统,观察Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的微管系统有无不同。3.对出生1天的同窝Spag6+/+和Spag6-/-小鼠耳蜗基底膜进行铺片,行免疫荧光染色,观察核心极性蛋白FZD6的分布有无不同。4.对内耳基底膜进行铺片及免疫荧光染色,观察Spag6+/+和.Spag6-/-小鼠内耳毛细胞的形态和极性,并对纤毛束的偏移角度进行统计。5.内耳基底膜行免疫荧光染色和扫描电镜,观察Spag6+/+和.Spag6-/-小鼠内耳毛细胞的一对中心粒、动纤毛和纤毛束三者之间的位置关系,并对动纤毛相对于纤毛束的偏移角度进行统计。结果1.Spag6+/+小鼠听力结果：ABR的click声刺激反应平均阈值为30.00±2.21 dB,ABR纯音刺激4k.8k.16k.32kHz的听力阈值分别为63.33±2.20、37.78±2.78、32.22±2.78和72.22±1.47dB,CM平均阈值40±4.08dB；spag6-/-小鼠听力结果：ABR的click声刺激反应平均阈值70.71±4.14 dB,ABR纯音4k.8k.16k.32kHz的听力阈值分别为85.71±2.29、74.29±2.97、72.86±3.60和90dB,三只纯合小鼠CM在80dB均无法引出。Spag6+/+小鼠和Spag6-/-小鼠的ABR及CM结果均具有明显统计学差异。2.Spag6+/+小鼠毛细胞表皮板的微管系统,以中心粒和动纤毛为中心,向细胞质放射状排列。而Spag6-/-小鼠毛细胞表皮板的微管系统发生了改变,微管排列错乱,并随动纤毛和中心粒的移位发生了偏移。3. Spag6+/+j小鼠的核心极性蛋白FZD6呈极性分布：；而Spag6-/-小鼠FZD6蛋白分布失去极性,在细胞膜上随机分布。4.Spag6+/+小鼠基底膜毛细胞的一排内毛细胞和三排外毛细胞排列整齐,“八”字形纤毛束开口方向朝向内侧,即耳蜗神经的方向；耳蜗基底膜宽度由顶转向底转变窄。而Spag6-/-小鼠的毛细胞大量积聚在耳蜗的顶转区域,听觉上皮区域明显变宽；同时Spag6-/-小鼠毛细胞纤毛的极性发生了很大偏移,表现为方向各异。5.Spag6+/+小鼠的一对中心粒所在直线与组织极性轴平行,动纤毛位于纤毛束“八”字形的顶点。而Spag6-/-小鼠的一对中心粒所在的直线不再与组织极性轴平行,动纤毛与纤毛束的相对位置关系发生改变。结论Spag6基因缺失可使小鼠听力损失,这种作用可能是通过参与调节小鼠内耳听觉上皮的平面极性实现的。第二部分Sperm-Associated Antigen 6 (Spag6)基因敲除导致小鼠出现中耳炎目的Sperm-Associated Antigen 6 (Spag6)基因编码中心微管蛋白,对纤毛和鞭毛的运动十分重要。最近研究发现,.Spag6对纤毛的发生、纤毛小根排列的方向和平面细胞极性的调节十分重要。极性排列的纤毛对中耳的正常功能具有重要意义,可以抵御细菌感染和清除中耳分泌物；纤毛结构或功能异常可导致中耳炎。然而,Spag6基因对于中耳的作用至今未见报道。本研究利用Spag6基因敲除小鼠,探讨Spag6基因缺失对小鼠中耳的影响。方法1. RT-PCR和免疫荧光检测Spag6在Spag6+/+和Spag6-/-小鼠中耳的表达。2.耳镜观察Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的鼓膜和中耳腔,制作HE切片染色判断中耳炎的发生情况。3.灌注固定后取Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的中耳及咽鼓管的纤毛上皮,使用扫描电镜观察纤毛情况。4.透射电镜观察Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的中耳及咽鼓管的纤毛小根及一对中心微管的方向。5.对Spag6+/+和Spag6+/-小鼠的中耳粘膜上皮进行铺片和免疫荧光染色,观察核心极性蛋白FZD6的分布情况。6.分别使用细菌培养、菌落计数、PCR鉴定、粘液卡红染色、Realtime-PCR、咽鼓管角度测量的方法,分别观察Spag6+/+和Spag6-/-小鼠中耳的细菌情况、杯状细胞的分布情况、粘液因子Mucin5ac和Mucin5b的表达情况以及咽鼓管角度是否异常。结果1. RT-PCR和免疫荧光染色结果显示：Spag6在Spag6+/+小鼠中耳和咽鼓管的纤毛上皮有表达且表达于纤毛；RT-PCR和免疫荧光均未检测到Spag6基因在Spag6-/-小鼠的中耳或咽鼓管有表达。2.耳镜显示1月龄Spag6+/-小鼠鼓膜完好光滑,光锥明显,中耳腔未见异常；而同窝Spag6-/-小鼠透过鼓膜可见气泡及积液；HE切片染色显示Spag6-/-小鼠中耳腔及咽鼓管内有渗出液体和炎性细胞,6月龄小鼠出现鼓室硬化,同窝Spag6+/+小鼠鼓室腔未见明显异常。3.扫描电镜显示生后25天Spag6-/-小鼠的鼓室上皮纤毛出现倒伏错乱,部分区域稀疏；而野生型小鼠纤毛密度未见降低,纤毛方向一致；Spag6-/-小鼠的骨岬的纤毛已经丧失,而Spag6+/+小鼠仍然存在。4.透射电镜显示Spag6-/-小鼠中耳上皮的纤毛小根方向错乱,纤毛的一对中心微管所在直线方向不一致；而Spag6+/+小鼠纤毛小根的方向一致,所有纤毛的一对中心微管所在直线平行,基本指向同一方向。5.免疫荧光染色显示FZD6蛋白在Spag6+/+小鼠中耳的纤毛上皮细胞的胞膜上呈极性分布,而FZD6蛋白在Spag6-/-小鼠的分布则失去极性。6.细菌培养、菌落计数和使用PCR鉴定小鼠中耳鼓室细菌显示,Spag6+/+和Spag6-/-小鼠中耳腔中均存在卡他莫拉菌,且菌落数量无明显统计学差异；粘液卡红染色显示Spag6-/-小鼠的杯状细胞较Spag6+/+小鼠未见明显增多；realtime-PCR显示粘液因子Mucin5ac和Mucin5b的mRNA在Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的中耳表达无明显差异；咽鼓管角度测量显示Spag6+/+和Spag6-/-小鼠的咽鼓管角度无明显统计学差异。结论Spag6基因缺陷可导致Spag6-/-小鼠出现中耳炎,这可能是由于中耳上皮纤毛的结构和摆动方向出现异常；而纤毛结构和摆动方向异常可能是由于Spag6基因参与了中耳上皮极性的调节和Spag6缺失影响了这种极性调节所致。