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目的:紫杉醇(Paclitaxel,PTX)作为一种用于癌症治疗的微管药物,具有促进微管稳定和诱导细胞凋亡的药理学活性;在临床治疗上,常用于治疗乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌和胰腺癌等多种癌症。与其他常用化疗药物不同,紫杉醇也可通过刺激巨噬细胞释放TNF-α来抑制肿瘤。巨噬细胞是一类重要的固有免疫细胞,在抗微生物感染、免疫稳态和组织修复中发挥重要的作用。它们通过细胞表面和细胞内的模式识别受体识别病原相关分子模式,表达相关蛋白并组成炎症小体,成为caspase-1活化的平台,继而加工pro-IL-1β、pro-IL-18、gasdermin D等蛋白,促进炎症反应。因此,炎症小体的活化是巨噬细胞发挥抗感染作用最重要机制之一。近年来已有研究表明微管在调节NLRP3炎症小体活化中扮演重要的角色,如秋水仙碱可以抑制NLRP3炎症小体的活化,用于治疗痛风(Gout)和贝赛特氏症(Beh?et’s disease)。但同样作为微管药物的紫杉醇是否会通过微管影响巨噬细胞中NLRP3炎症小体的活化,目前还没有这方面的报道。据此,本课题主要研究紫杉醇对ATP或者尼日利亚菌素(Nigericin)诱导的巨噬细胞NLRP3炎症小体活化的影响,并探索其潜在的作用机制,为其在对抗感染和治疗其它炎症性疾病方面的潜在应用提供实验证据。方法:1.采用碘化丙锭(propidium iodode)染色方法检测紫杉醇对ATP或者尼日利亚菌素(Nigericin)诱导的预先经LPS致敏的小鼠J774A.1细胞系、人THP-1以及小鼠骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMDM)焦亡的影响。2.利用蛋白质印迹法(Western blotting)检测上述细胞炎症小体活化的指标,包括细胞培养上清中IL-1β和caspase-1p10的水平,及细胞裂解物中pro-IL-1β、pro-caspase-1的表达量和gasdermin D活化(被caspase-1剪切后一个产生N端片段,可在细胞膜上成孔,导致细胞焦亡)情况。3.采用免疫荧光的方法观察ASC specks形成,以及分析乙酰化α-微管蛋白(Acetyl-α-tubulin)的分布情况。4.利用流式微球捕获蛋白定量技术(cytometric beads array,CBA)检测细胞培养上清中IL-1β水平。5.利用乙酰化α-微管蛋白抑制剂白藜芦醇(Resveratrol)和NAD~+增强微管蛋白去乙酰酶(SIRT2)的活性,以及利用siRNA敲低微管蛋白乙酰转移酶(MEC-17)的表达,检测紫杉醇诱导α-微管蛋白乙酰化在其促进NLRP3炎症小体活化和细胞焦亡中的作用。6.将大肠杆菌活菌(E.coli)腹腔注射至小鼠体内建立细菌感染模型,以CBA流式微球捕获蛋白定量技术分析血清中IL-1β水平,肝脏组织化学技术分析炎症细胞浸润,采用NanoDrop 2000超微量紫外可见光分光光度计检测腹腔液中细菌的密度,并用LB固体培养板涂布法计算相关菌落形成单位(CFU);分析上述小鼠模型的存活率。结果:1.紫杉醇可增强ATP或Nigericin诱导的巨噬细胞炎症小体活化,促进成熟IL-1β的释放,增加ASC specks的形成,提高gasdermin D的活化以及细胞焦亡。紫杉醇对NLRP3炎症小体的促进作用呈剂量依赖效应,但不影响NLRC4炎症小体和AIM2炎症小体的活化。2.紫杉醇可以促进α-微管蛋白的乙酰化水平,并具有时间和剂量依赖效应。3.紫杉醇可进一步增强巨噬细胞中ATP或者Nigericin介导的α-微管蛋白乙酰化。4.α-微管蛋白乙酰化的抑制剂——白藜芦醇和NAD~+(后者为去乙酰化酶SIRT2的辅酶),以及利用siRNA敲低MEC-17的表达,能显著地阻断紫杉醇和NLRP3炎症小体诱导剂(ATP或者Nigericin)诱导的α-微管蛋白乙酰化,且可明显逆转紫杉醇对上述诱导剂诱导的NLRP3炎症小体和细胞焦亡的促进作用。5.紫杉醇能明显提高上述模型小鼠的存活率;检测显示,紫杉醇可上调模型小鼠中血清IL-1β的水平,降低腹腔中的细菌密度,并减轻肝组织损伤。结论:1.紫杉醇可促进LPS致敏的巨噬细胞经ATP或者Nigericin刺激诱导的炎症小体活化和细胞焦亡;2.紫杉醇的上述效应,与其促进α-微管蛋白乙酰化有关。3.体内与体外实验相互印证,说明紫杉醇可增强巨噬细胞抗感染免疫功能,从而提高其对细菌的杀伤与清除作用。