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UV-B(Ultraviolet Radiation B)是影响植物生长发育的重要因素之一,作为一种常见的环境因子,它不仅影响植物的形态结构和生理代谢,而且影响植物果实的品质。葡萄富含花青素,可溶性糖和有机酸以及天然植物多酚,芪类化合物是常见的植物多酚,具有良好的生物活性,Trans-scirpusin A是研究较少但关注度高的芪类化合物,作为葡萄品质功能因子其药理活性深受人们的关注,但其合成路径却鲜有研究报道。本文以葡萄为材料,研究了 UV-B辐射对葡萄生理方面的影响,围绕关键品质功能因子Trans-scirpusin A的生物合成机制,利用转录组测序技术筛选获得Trans-scirpusin A生物合成关键基因(SAH)并对关键基因进行克隆表达与亚细胞定位分析,主要研究内容结果如下:(1)UV-B辐射对葡萄生理的影响是多方面的。UV-B辐射胁迫后,葡萄超氧化物歧化酶(SOD),过氧化物酶(POD)活性都随着胁迫时间增加而升高,其中POD活性变化幅度最大,酶活性变化范围为35.63～66.99 U·g-1·min-1,SOD受UV-B辐射影响活性变化趋势虽与POD一致,但变化幅度低于POD,其变化范围为40.96～63.82 U·g-1·min-1。过氧化氢酶(CAT)活性在UV-B辐射60 min时达到最大值23.09 U·g-1·min-1,活性变化趋势先升后降,活性变化幅度受UV-B辐射影响最小。随着UV-B辐射时间的增加,葡萄中葡萄糖,果糖,蔗糖含量均不同程度的升高。UV-B辐射对葡萄可溶性糖影响程度为葡萄糖>果糖>蔗糖>山梨醇。UV-B辐射后,葡萄中有机酸的含量也会发生变化,UV-B辐射对不同的有机酸影响不同,且会显著影响单种有机酸在总有机酸的占比。葡萄中芪类化合物的含量均与UV-B辐射时间呈正相关,不同的芪类化合物受UV-B辐射影响含量变化不同,白藜芦醇单体含量对UV-B辐射响应幅度最大,其次是 Trans-ε-viniferins 和 A,UV-B 辐射对 Trans-δ-viniferins和紫檀芪的影响最小。(2)基于转录组测序结果从基因表达差异水平分析了 UV-B辐射30 min对葡萄的影响,结果表明UV-B辐射30 min后与未处理的相比,共有13906个差异表达基因,根据GO注释分类,其中5560个差异表达基因属于生物过程分类,5024个差异表达基因被归类到细胞组成分类中,3322个差异表达基因归类于分子功能范畴。同时将差异表达基因进行KEGG代谢途径分类和功能富集,结果共有4891个差异表达基因被归类到5个主要的KEGG代谢途径中,其中208个差异表达基因被归类到细胞过程,259个差异表达基因与环境信息加工相关,1017个差异表达基因与遗传信息加工相关,2988个差异表达基因与新陈代谢相关,394个差异表达基因与生物体系统相关。差异表达基因主要富集在核糖体、植物病原相互作用和黄酮类化合物生物合成三大区域。结合GO,KEGG注释和参照基因HsCYP1B1比对结果,筛选获得3个可能的Trans-scirpusin A生物合成基因并对其进行RT-qPCR验证。(3)综合基因差异表达倍数和基因同源性分析,选择可能性最大的SAH基因进行后续分析,该SAH基因基因开放阅读框(ORF)长837 bp,它编码了278个氨基酸,通过计算得出蛋白的等电点为6.63,分子量大小为31.8 Kda。借助DNAman分析软件和NCBI网站BLAST功能,将目的基因与其他四种具有羟基化功能的CYP基因进行比对,该基因与人参的同源性为68.19%,与莲藕的同源性为70.95%,与参照基因的同源性为39.98%,与葡萄的另一个已知的CYP基因同源性为51.94%。对筛选获得Trans-scirpusin A合成的关键基因进行克隆表达分析与亚细胞定位分析。SDS-PAGE实验结果和Western blot结果表明该目的片段被成功转入毕赤酵母,目的蛋白能稳定表达,蛋白的分子量大小为31.8 KDa与预期一致,且具有体外催化功能。亚细胞定位分析实验结果表明该目的蛋白的表达部位主要是细胞核,少量在细胞膜上表达,这与亚细胞定位预测结果相一致。