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细胞外囊泡(EVs)是指细胞内携带的大分子物质转运至细胞外发挥生物学功能的双层膜囊泡。EVs的释放和摄取是细胞间通讯的新机制,其分离纯化及内容物(主要组成物质)功能的研究是现代生物学领域一个热点问题。卵巢的重要功能是产生卵泡和维持卵泡发育、产生卵子。卵泡发生的过程涉及复杂的细胞间通讯和细胞代谢、细胞增殖,卵泡膜细胞、颗粒细胞和卵母细胞在整个卵泡生长和成熟过程中分泌多种细胞因子和蛋白因子,参与卵泡发育。卵泡液中存在由卵泡组成的颗粒细胞、卵丘细胞、卵母细胞等分泌的EVs,通过一些特殊的转运途径影响卵泡发育和卵巢生物学功能。卵巢皮质间质细胞增殖和类固醇激素生成对卵泡发育、闭锁关系密切。卵泡液EVs对卵巢皮质间质细胞增殖和类固醇激素生成的调控作用目前还不清楚,本研究通过探究卵泡液EVs对卵巢皮质间质细胞增殖和类固醇激素生成的影响,为阐明卵泡液EVs对卵泡发育的影响和调控作用奠定基础。研究结果如下:1.牛卵泡液EVs的分离纯化从牛卵巢小卵泡(3-5mm)抽取卵泡液,采用差速超速离心法,经过多步离心,从卵泡液中提取EVs。用电镜观察、Western blot检测和纳米粒径技术对提取的卵泡液EVs进行纯度鉴定。电镜下观察到所提取的卵泡液EVs呈典型的杯状的双层膜囊泡结构,大小为50～150nm;蛋白印迹检测结果证实提取的卵泡液EVs含有标志蛋白CD63和TSG101,未检测到内质网标志蛋白GP96;纳米粒径检测证明提取的卵泡液EVs与EVs所描述的大小一致,EVs直径主要集中于50-150nm。表明提取的卵泡液EVs纯度高,且无内质网污染。2.牛卵巢皮质间质细胞的分离培养与纯化在无菌条件下,从牛卵巢组织中通过机械分离与酶消化相结合的方法分离卵巢皮质间质细胞,通过差速贴壁法对其纯化并进行纯度鉴定。结果显示分离得到的细胞检测波性蛋白阳性,角蛋白阴性,间质细胞纯度较高。3.皮质间质细胞对牛卵泡液EVs的摄取为了证明卵泡液EVs可以被卵巢皮质间质细胞摄取,用PKH67标签标记的EVs处理卵巢皮质间质细胞,用共聚焦显微镜观察PKH67所带绿色荧光的细胞定位。结果显示,用PKH67-EVs处理组的绿色荧光分布在皮质间质细胞的细胞质内,表明PKH67通过EVs进入了皮质间质细胞,证明了卵泡液EVs可被卵巢皮质间质细胞摄取。4.牛卵泡液EVs对卵巢皮质间质细胞增殖的影响用含0μg/mL,10μg/mL,30μg/mL和100μg/mL卵泡液EVs处理卵巢皮质间质细胞,连续5天进行CCK检测并用公式计算增殖率,从而评估卵巢皮质间质细胞的增殖情况,结果显示与0μg/mL和10μg/mL卵泡液EVs组相比,30μg/mL和100μg/mL卵泡液EVs能促进卵巢皮质间质细胞增殖。用TUNEL检测细胞凋亡情况,结果显示与0μg/mL和10μg/mL卵泡液EVs组相比,30μg/mL和100μg/mL卵泡液EVs能抑制卵巢皮质间质细胞凋亡。用含0μg/mL,10μg/mL,30μg/mL和100μg/mL卵泡液EVs处理卵巢皮质间质细胞24h后,RT-qPCR进行凋亡相关基因(BAX和CASPASE3)和抗凋亡基因(BCL2)检测,结果显示,与0μg/mL,10μg/mL和30μg/mL卵泡液EVs组相比,100μg/mL卵泡液EVs能显著抑制卵巢皮质间质细胞BAX的表达并能促进BCL2的表达(P<0.05),而对CASPASE3的表达影响不显著(P>0.05),且能使BCL2和BAX的比率增加(P<0.05),这与TUNEL检测的结果一致。表明EVs可抑制皮质间质细胞凋亡而促进其增殖。5.牛卵泡液EVs对卵巢皮质间质细胞类固醇激素生成的影响。用含0μg/mL,10μg/mL,30μg/mL和100μg/mL卵泡液EVs处理卵巢皮质间质细胞,24h后,使用Elisa的方法检测中雄烯二酮以及孕酮的激素表达。结果显示,与0μg/mL和10μg/mL卵泡液EVs组相比,30μg/mL和100μg/mL卵泡液EVs显著促进卵巢皮质间质细胞雄烯二酮和孕酮的合成(P<0.05)。用含0μg/mL,10μg/mL,30μg/mL和100μg/mL卵泡液EVs处理卵巢皮质间质细胞,24h后使用RT-qPCR检测卵巢皮质间质细胞STAR、CYP11A1、3β-HSD以及CYP17A1基因的表达,结果显示,与0μg/mL和10μg/mL卵泡液EVs组相比,30μg/mL和100μg/mL卵泡液EVs可促进卵巢皮质间质细胞CYP11A1、3β-HSD以及CYP17A1基因的表达(P<0.05),而对STAR基因表达无影响(P>0.05)。结论:牛卵泡液EVs可作用于卵巢皮质间质细胞,能促进细胞增殖,促进雄烯二酮以及孕酮的生成。