论文部分内容阅读
几丁质经脱乙酰后形成壳聚糖,目前壳聚糖生产有生物法与化学热碱法两种工艺。几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA,E.C.3.2.1.4)是生物法制备壳聚糖的关键。生物法相较热碱法制备壳聚糖,它具有诸多优点,如可生产特异性高的壳聚糖、产品均一性好、生产过程条件温和、节约成本、环境污染少等。本文以海边红树林虾场土壤中筛选出的产CDA菌株放线菌Micromonospora aurantiaca为对象,对CDA的最佳发酵条件,分离纯化方法,以及CDA的酶学性质进行了研究。本文主要的研究内容和结果如下:1.产CDA酶菌株的筛选与鉴定从海边红树林虾场采集的土壤样本,经过初筛、复筛,挑选出产CDA的菌株。将筛选出的编号为1-1-1的菌株进行形态特征、16SrDNA测定等,结果显示,与Micromonospora aurantiaca同源性最高 98%。2.Micromonospora aurantiac 菌株产CDA的发酵条件优化在单因素试验结果的基础上利用正交试验优化了 Mfcromonospora aurantiantiaca产CDA的最佳发酵条件。培养基组分%(m/v)：葡萄糖0.5%,酵母浸膏1.0%,CaC120.15%,胶体几丁质0.03%,NaCl1.0%;培养条件:种龄56 h,接种量4%(v/v);发酵温度30℃,起始pH7.0。装液量20%(v/v),转速180r/min,发酵时间84h。经优化后的发酵条件,CDA的酶活达23.53 U/mL,比未优化前提高了 1.78倍。3.CDA的分离纯化将发酵粗酶液经过超滤浓缩→冷冻干燥→DEAE-纤维素离子交换层析→透析袋透析除盐→PEG 4000浓缩→冷冻干燥→Sephadex G-100凝胶过滤层析→重复除盐、浓缩干燥等步骤后,经SDS-PAGE电泳,检测到单一条带的CDA,分子量约为81.8 KDa。其中DEAE-纤维素离子交换条件确定为层析柱规格:Φ1.6×30 cm;柱体积:60 cm3;上样量:1.2mL;流速:1.2mL/min;洗脱液:50mMpH7.2Tris-HCl;Sephadex G-100凝胶柱条件确定为层析柱规格:Φ1.6×50 cm;柱体积:100 cm3;上样量:1.2 mL;流速:1.4mL/min;洗脱液:50mMpH7.2Tris-HCl4.CDA的酶学性质研究考察pH、温度、金属离子对Micromonospoa auraiaaca来源CDA的酶活性影响。利用红外光谱法、扫描电镜检测纯化后的CDA对几丁质的脱乙酰效果。实验结果表明,该菌属来源的CDA的最适pH为7.0;最适温度为40℃;Ca2+、K+对CDA有促进作用,2n2+表现出明显的抑制作用,Mg2+、Cu+表现为轻度抑制作用。红外光谱结果显示,纯化后的CDA将几丁质脱乙酰度从39.03%提升至78.40%,扫描电镜显示脱乙酰后的几丁质表面结够变得疏松多孔、出现凹槽、晶体消失,进一步印证了该提纯的CDA有明显的脱乙酰效果。