红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)的诱变和原生质体融合及发酵优化研究

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本论文对红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)的诱变和筛选,高产虾青素突变株的培养特征,发酵助剂对虾青素合成的促进作用,高产虾青素突变株与啤酒酵母的原生质体融合以及融合株发酵特征进行了研究。 利用亚硝基胍对红发夫酵母进行重复诱变,经过二苯胺、β-紫罗酮的筛选,得到一株高产类胡萝卜素的突变株NT221,YM培养基摇瓶培养虾青素含量达到1,200μg/g,比亲株提高50%。研究发现,突变株NT221对酵母抑制剂2-脱氧葡萄糖、制霉菌素、抗霉素A、放线菌酮、CuSO4的抵抗能力比亲株强。培养基中添加500mg/L CuSO4有助于阻止菌种产类胡萝卜素能力的退化。 研究了摇瓶培养条件下温度、pH、装液量、接种量对NT221生物量、虾青素含量及产量的影响。20℃最有利于虾青素的积累和细胞生长。pH4.0最有利于酵母的生长,pH5.0最利于虾青素的积累;低装液量有利于细胞的生长和虾青素的形成;接种量5~10%较适宜细胞生长及虾青素的合成。正交设计L16(45)研究结果表明:在装液量、温度、培养时间、pH、接种量五个因子中,装液量是影响细胞生长和虾青素形成的最显著因子。其次是温度。 对于红发夫酵母生长和虾青素的合成最好的碳源为葡萄糖、棉子糖、蔗糖,最好的氮源是蛋白胨、酵母粉和玉米浆;在四种磷酸盐中磷酸氢二钾最益于虾青素的合成;用正交设计优选出最佳的摇瓶培养基是:葡萄糖20g/L,玉米浆5g/L,K2HPO4 1g/L,MgSO4 2g/L,酵母粉3g/L。 对红发夫酵母突变株NT221在5L反应器中的发酵特征研究表明:流加培养比分批培养的生物量和虾青素产量有较大幅度的提高,分别提高46.8%和49.8%;在流加培养中,流加葡萄糖的方式对生物量及虾青素产量产生影响,以pH-stat控制的葡萄糖流加比间歇流加其生物量和虾青素产量分别提高14.5%和2.5%。 一些特殊生长因子和无机盐可作为发酵助剂在一定浓度下提高虾青素含量和产量。肌醇在30mg/L时虾青素含量提高率高达34.1%;L-赖氨酸在100mg/L时虾青素含量提高率达到36.7%;核黄素在7.5mg/L时虾青素的含量比对照提高了35.4%。0.5mg/L氯酸钠可使虾青素含量提高30.6%,0.5mg/L的氯化镉可使虾青素的含量提高31.4%。 原生质体形成率与细胞的生理状态有关。装液量为70-100mL/250mL三角瓶、0-3代酵母、培养时间12h,培养基中添加200~400mg/L的MnCl2,这些条件可使红发夫酵母原生质体形成率达到80~90%。红发夫酵母原生质体形成率和再生率最佳酶解条件是:pH8.0、0.8mol/LKCl、溶壁酶浓度10mg/mL、酶解时间16h和酶解温度22℃。啤酒酵母原生质体形成率和再生率最适的条件是:菌体培养时间12h、溶壁酶浓度10mg/mL、酶解温度3℃和酶解时间1h;红发夫酵母和啤酒酵
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