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CD4和CD8分子是T淋巴细胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白,也是T淋巴细胞重要的表面标志。CD4和CD8分子作为粘附分子、辅助受体和免疫调节物广泛参与TCR对MHC分子递呈抗原的识别和信号传递。CD4+T细胞识别MHCⅡ类分子递呈的抗原,而CD8+T细胞识别MHCⅠ类分子递呈的抗原。CD4和CD8分子还是一类信号传递受体,两者分子胞质内部分与非受体型蛋白酪氨酸激酶Src家族p56lck相连,参与经TCR介导的信号级联反应。最近的研究结果表明,CD4分子还是HIV感染人T淋巴细胞的辅助受体。CD8αα同型二聚体分子在小鼠肠上皮下与非典型MHCⅠ类分子作用,构成肠道免疫屏障。鸡和哺乳动物的CD4和CD8分子在结构和功能上的相似性很明显,它们与鸡的免疫防御紧密相关,影响机体的细胞免疫和体液免疫。为制备针对鸡CD4和CD8α分子的抗体,初步了解这两种膜蛋白分子在机体特异性免疫应答中的作用及其机理,本研究进行了鸡CD4和CD8α基因的克隆和原核表达。首先根据GenBank登录的鸡CD4和CD8α基因序列设计两对引物,通过反转录-聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术,从经刀豆素A(Concanavalin A,ConA)诱导活化的鸡胸腺淋巴细胞总RNA中分别扩增出两条特异性基因片段,经单酶切鉴定,与GenBank中登录的鸡CD4和CD8α基因序列含有相同的单酶切位点。PCR产物分离纯化后连接到pMD18-T载体,经菌液PCR筛选出阳性重组克隆后进行序列测定。结果表明本实验成功的克隆到鸡CD4和CD8α基因,两者分别由1380和651个核苷酸组成,分别编码460和217个氨基酸。所克隆的鸡CD4基因与GenBank中登录的鸡CD4基因相比较,都只有1个核苷酸的差异,导致1个氨基酸的改变,同源性均为99%。同样,所克隆的鸡CD8α基因与GenBank中登录的两条鸡CD8α基因相比较,都有12个核苷酸的差异,分别导致8个和9个氨基酸的变化,同源性为98%。其次,根据本实验测定的鸡CD4、CD8α基因序列和原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆酶切位点序列设计两对引物,应用PCR技术从重组质粒pMD18-T-CD4和pMD18-T-CD8α中扩增出编码鸡CD4和CD8α分子膜外IgSF结构域的基因片段,分别编码鸡CD4胞膜外区远端IgSF D1、D2功能结构域和CD8α链胞膜外区的IgSF V功能结构域,这两个基因片段长度分别为579bp和366bp。PCR产物分离纯化后连接到原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆酶切位点,经质粒PCR和EcoRⅠ、SalⅠ双酶切鉴定,筛选出阳性重组克隆,构建成CD4和CD8α基因膜外片断的原核表达质粒。将这两种原核表达重组质粒pGEX-4T-1-CD4和pGEX-4T-1-CD8α转化大肠杆菌BL21,经37℃和1.0mmol/L IPTG的诱导,SDS-PAGE凝胶电泳表明所克隆的基因片段在大肠杆菌中得到融合表达,表达出谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与CD4和CD8α的融合蛋白GST-CD4和GST-CD8α,且表达产物主要以包涵体的形式存在。所获得的融合蛋白分子量分别约为47 KD和39 KD,与预期结果相符。最后,通过优化原核表达条件,确定了原核表达重组质粒pGEX-4T-1-CD8α的最佳诱导时间和诱导剂浓度,我们用优化的原核表达条件对含有pGEX-4T-1-CD8α质粒的BL21菌进行了大量诱导表达,实验中使用反复冻融和超声方法来裂解诱导表达菌,获得了较高浓度的GST-CD8α包涵体蛋白,用十二烷基肌氨酸钠加超声波的方法使包涵体充分溶解,提取了大量的可溶性GST-CD8α原核融合表达蛋白。综上所述,本研究成功地克隆了鸡CD4和CD8α基因,并进行了两者的原核表达,获得了大量的GST-CD8α原核融合表达蛋白,这些都为进一步研究鸡CD4和CD8α分子免疫学功能及其应用提供了试验材料。