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第一部分假单胞菌属WBC-3菌株4-硝基苯酚代谢途径中关键蛋白PnpB和PnpE结构和功能的研究
4-硝基酚(对硝基苯酚，PNP)是一种重要的化工原料，对人体有很强的毒性与致癌性。硝基酚类化合物可以抵抗一般生物氧化酶的攻击，因此进入环境的对硝基苯酚会长期残留在土壤和水中，对动植物生存、人类健康产生了很大的威胁。目前，降解环境中的对硝基苯酚仍然是一个世界性的难题。用传统的物理和化学方法进行处理，工艺复杂、成本高，而且容易产生二次污染，不能完全清除污染物。研究发现利用微生物来实现污染物的去除，及微生物修复技术，不仅能够实现污染物的完全脱毒，而且没有复杂的前处理或抽提过程，因此是一种环境友好的污染治理方法。
4-硝基酚的微生物代谢研究一直受到人们的关注，目前已有多株能够完全代谢4-硝基酚的细菌纯培养物的报道。与此同时，关于4-硝基酚代谢的分子机制的研究也受到了广泛的关注。研究发现微生物降解4-硝基酚的途径主要有两条，根据中间产物的不同，分为对苯二酚途径和偏苯三酚途径。对苯二酚代谢途径广泛存在于革兰氏阴性菌中，以Moraxella菌研究为代表(Spain，1991)。在该途径中，4-硝基酚首先被氧化为对苯二醌(p-benzoquinone)，对苯二醌在还原酶作用下还原为对苯二酚(hydroquinone)，然后进入开环途径。偏苯三酚途径大多存在于革兰氏阳性菌中，以Arthrobacter sp.JS443(Jain，1994)，Bacillus sphaericus JS905(Kadiyala，1998)为代表，在该途径中，4-硝基酚在2-和3-位羟化形成苯三酚(1，2，4-benzenetriol，hydroxyquinol)，进入开环途径。
目前，分子生物学研究已经获得了对苯二酚代谢的完整的基因簇，并且鉴定了参与代谢途径的关键酶的功能。其中4-硝基酚单加氧酶(PnpA)催化4-硝基酚氧化为对苯二醌，对苯二醌还原酶(PnpB)催化对苯二醌还原为对苯二酚。参与4-硝基酚下游代谢途径的酶包括：PnpCD是对苯二酚双加氧酶的α和β亚基，催化对苯二酚开环生成γ-羟基粘康酸半醛；PnpE是γ-羟基粘康酸半醛脱氢酶，催化γ-羟基粘康酸半醛生成马来酰乙酸；PnpF是马来酰乙酸还原酶催化马来酰乙酸生成β-酮己二酸酯，继而进入中心代谢途径(TCA循环)。
为了进一步研究每一步酶催化反应的化学机制，需要对每一步的酶的三维结构进行测定。因此本论文运用X射线晶体学方法在原子水平上测定了Pseudomonas sp.WBC-3中参与降解PNP反应的酶PnpB与PnpE的三维结构及其与辅因子的复合物的三维结构。研究了这两种蛋白质的折叠类型、活性中心的结构与氨基酸组成，从分子水平上深入阐述其催化机理及催化动力学过程。主要内容包括以下几个方面：
(1)Apo-PnpB，PnpB-FMN复合物晶体的获得和结构的解析。首先克隆Pseudomonas sp.WBC-3中的pnpB基因，构建表达质粒后将其转化到大肠杆菌中，获得阳性克隆子之后，纯化重组蛋白质，将重组蛋白质进行晶体的生长。晶体进行优化后，通过X射线衍射，apo-PnpB和PnpB-FMN复合物晶体分别得到了2.1A和1.7A的数据，最终解析出了两者的蛋白质结构。
(2)Apo-PnpE，PnpE-NAD复合物晶体的获得和结构的解析。通过克隆Pseudomonas sp.WBC-3中的PnpE基因，将其转化到大肠杆菌中获得阳性克隆子之后，纯化重组蛋白质，将重组的蛋白质进行晶体的生长。晶体进行优化后，通过X射线衍射，apo-PnpE和PnpE-FMN复合物分别得到了2.7A和3.0A的数据，最终解析出了两者的蛋白质结构。
(3)解析了apo-PnpB，PnpB-FMN的结构，确定了PnpB具有βαβ典型的黄素氧还蛋白特征结构域。阐明了辅因子FMN在PnpB中的位置，以及PnpB中与FMN相互作用的氨基酸。并且通过Autodock的方法得到了PnpB-FMN-BQ和PnpB-FMN-NADPH的结构模型，通过此模型研究了PnpB结合底物BQ的活性位点的结构，以及与BQ相互作用的关键氨基酸，并通过生化定点突变进行验证。研究了PnpB另外一个辅因子NADPH与PnpB的相互作用。确定了PnpB与NADPH相互作用的氨基酸，并且也通过生化定点突变进行验证。并从分子水平上给出了PnpB催化底物对苯醌的反应机制。
(4)解析了apo-PnpE，PnpE-NAD的结构，确定了PnpE底物结合结构域，辅因子结合结构域以及二聚化的结构域。弄清了辅因子NAD在PnpE中的位置，以及PnpE与NAD相互作用的氨基酸。通过比较PnpE-Native和PnpE-NAD的结构，发现了一段与NAD结合有关的loop(Leu246-Gly252)，在催化机制中的作用。通过比较PnpE与同源蛋白BADH的结构，我们阐明了PnpE辅酶特异性结合辅因子的结构基础。利用Autodock分子对接的方法我们得到了PnpE与底物γ-羟基粘糠醛(γ-hydroxymuconic semialdehyde)复合物的结构模型，阐明了PnpE与底物相互作用的九个氨基酸在催化反应中的作用，并通过生化定点突变进行了验证。