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背景与目的结肠癌是消化系统中相当常见的肿瘤,它的化疗敏感性差,治愈率不高。研究发现,环氧合酶-2(COX-2)在化疗耐药的结肠癌细胞中表达增高,通过抑制COX-2能提高结肠癌的化疗敏感性。因此,寻找更有效的抑制COX-2的途径对结肠癌的治疗具有十分重要的意义。目前研究发现,植物中一些能激活AMPK的提取物可以减少细胞内前列腺素的合成,同时又具有抑制肿瘤的作用,而COX-2是催化前列腺素合成的关键酶,因而推测这些AMPK的激活物质可能通过介导COX-2信号通路而产生抗癌效应。据报道,AMP激活的蛋白激酶( AMP-activated protein kinase,AMPK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它作为“细胞能量监测器”,能在细胞能量缺乏时中止细胞的扩增。但是,关于AMPK的激活抑制肿瘤的作用机制尚不清楚,AMPK的激活与COX-2表达关系的研究也比较少。为了解AMPK的激活对COX-2表达的影响及其在结肠癌中的作用,我们拟从组织标本和体外细胞培养两个层面进行研究,希望能够为结肠癌的治疗提供新的思路。研究方法1、采用免疫组织化学方法检测结肠癌组织标本中AMPK的激活和COX-2的表达,同时利用统计学方法分析AMPK的激活和COX-2表达的相关性及其与临床病理特征的关系。2、用AMPK激活剂AICAR作用于人结肠癌细胞株HT-29,通过Western Blot方法检测AMPK的激活对COX-2表达的影响。3、分别用AMPK激活剂AICAR和选择性COX-2抑制剂塞来昔布作用于人结肠癌细胞株HT-29,通过光学显微镜观察不同浓度的AICAR和塞来昔布在不同时间的作用后结肠癌HT-29细胞的生长状态,MTT方法检测其细胞存活率。4、采用吖啶橙荧光染色法观察AICAR和塞来昔布作用下的凋亡细胞,流式细胞术测定法检测其细胞凋亡率。5、联合AICAR和塞来昔布,通过MTT方法检测二者联用对细胞增殖的影响。结果1、在结肠癌组织切片免疫组化检测中,可观察到AMPK激活的下游靶分子P-ACC和COX-2蛋白的阳性染色均呈淡黄色至棕褐色颗粒状,分布于癌细胞的细胞浆部位,细胞膜和细胞核未见明显染色。P-ACC蛋白的阳性表达率在浆膜浸润组(4.9%)明显低于浆膜未浸润组(47.4%),组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。COX-2蛋白的阳性表达率在浆膜浸润组(95.1%)明显高于浆膜未浸润组(36.8%),组间比较差异有统计学意义(P<0.01);有淋巴结转移者(94.1%)明显高于淋巴结未转移者(69.8%),两者之间有显著性差异(P<0.05);Dukes肿瘤分期C～D者(94.1%)明显高于A～B期者(69.8%),两者之间有显著性差异(P<0.05)。Spearman等级相关分析显示P-ACC表达与COX-2表达呈负相关(r=0.655,p=0.001)。2、AMPK激活剂AICAR直接作用于人结肠癌细胞株HT-29后,Western Blot结果显示AMPK被激活后,COX-2蛋白表达减少。3、随着AICAR和塞来昔布浓度的增加,HT-29细胞数量逐渐减少,有细胞逐渐脱离生长面,死亡细胞逐渐增多;细胞形态发生改变,可以看到细胞核体积减小,细胞折光性差,细胞间隙明显增大。细胞存活率随时间、浓度增加而下降,二者的增殖抑制作用均呈剂量和时间依赖性。4、吖啶橙染色后,在荧光显微镜下观察,可见对照组细胞饱满,细胞膜光滑,发光均匀,为完整、圆形的绿染的细胞核;而塞来昔布组和AICAR组均可发现凋亡细胞明显增多,细胞呈完整或不完整的橙红色荧光。流式细胞术分析显示,塞来昔布组和AICAR组早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞比例均高于对照组(P<0.05)。5、AICAR和塞来昔布联用时,细胞的存活率为23.0±0.82%,均低于AICAR组(54.0±2.86%)和塞来昔布组(57.0±2.54%)。结论本课题分别在组织标本和体外细胞中对AMPK的激活影响COX-2表达进行了相关的研究,并对AMPK激活剂在结肠癌中的作用进行了探讨,认为:1、AMPK的激活和COX-2的表达均与结肠癌的浆膜浸润有关,AMPK失活、COX-2激活的结肠癌更具有侵袭潜能;结肠癌中AMPK的激活和COX-2的表达呈负相关。2、人结肠癌细胞株HT-29中AMPK的激活可能抑制COX-2的表达。3、激活AMPK可以抑制结肠癌HT-29细胞的生长增殖。4、激活AMPK可以诱导结肠癌HT-29细胞的凋亡。5、AMPK激活剂与选择性COX-2抑制剂对结肠癌HT-29细胞均有增殖抑制和诱导凋亡效应;AMPK激活剂和选择性COX-2抑制剂联用具有协同效应。