论文部分内容阅读
目的:砷（Arsenic,As）是一种公认的致癌物质,但砷的致病机制尚不清楚。上皮间质转化（Epithelial mesenchymal transition,EMT）是癌症进展过程中的关键形态学事件,本研究通过亚砷酸钠（NaAsO2）慢性诱导人支气管上皮细胞BEAS-2B发生EMT,探讨自噬对细胞发生EMT的作用机制,为砷相关疾病的预防和治疗提供实验依据。方法:1.细胞分组。急性砷处理组:BEAS-2B细胞经2.5μM亚砷酸钠刺激48小时,即As（2.5μM）组;慢性砷处理组:BEAS-2B细胞经0.25μM亚砷酸钠刺激16周,每隔3天传代一次,即As（0.25μM）组;As（0.25μM）组细胞通过软琼脂克隆形成实验,挑取单克隆培养获得转化细胞,即TB2B组。2.BEAS-2B/GFP-LC3细胞的构建。GFP-LC3载体经Lipofectamin 2000转染BEAS-2B细胞,经G418筛选12天,Western blot验证,获得BEAS-2B/GFP-LC3细胞系。3.亚砷酸钠慢性诱导对细胞自噬的影响。BEAS-2B/GFP-LC3细胞经2.5μM亚砷酸钠处理48小时,通过荧光显微镜观察细胞自噬体数量的变化,Western blot检测亚砷酸钠慢性处理后,自噬标志蛋白（Beclin-1,p62和LC3-II）表达水平。4.亚砷酸钠慢性诱导对细胞EMT及MEK/ERK1/2信号通路的影响。通过ERK1/2 siRNA转染TB2B细胞,Western blot检测ERK1/2、p-ERK1/2、E-cadherin和Vimentin的表达水平。使用qRT-PCR和western blot检测TB2B细胞EMT转录因子（ZEB1,Snail和Twist）的mRNA和蛋白表达水平。5.抑制自噬对EMT及MEK/ERK1/2信号通路的影响。采用巴弗洛霉素抑制TB2B细胞自噬,划痕实验和克隆形成实验检测细胞迁移和克隆形成能力,通过Western blot检测MEK/ERK1/2信号通路及EMT相关信号分子表达水平变化。6.敲除自噬基因对EMT的影响。采用CRISPR/Cas9技术敲除TB2B细胞Beclin-1基因,Western blot检测TB2B/Beclin-1-/-细胞（KO）的EMT相关蛋白表达水平,并应用transwell实验检测细胞迁移能力。7.阻断MEK/ERK1/2信号通路对转化细胞自噬的影响。MEK/ERK1/2信号通路被U0126阻断后,通过免疫印迹法检测Beclin-1、p-ERK1/2、Vimentin和EMT转录因子Snail的蛋白水平。8.统计分析方法。所有实验均独立进行3次,多组之间的比较采用单因素方差分析（ANOVA）,P<0.05代表差异具有统计学意义。结果:1.BEAS-2B细胞经亚砷酸钠刺激,自噬体数量增多。BEAS-2B细胞经2.5μM亚砷酸钠培养48小时,GFP-LC3标记的自噬体数量增加（P<0.05）,Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平增高（P<0.01,P<0.01）,但p62表达水平降低（P<0.05）。2.亚砷酸钠慢性诱导细胞自噬增强。BEAS-2B细胞经亚砷酸钠慢性处理后,Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达升高（P<0.01,P<0.001）,但p62表达降低（P<0.001）。3.亚砷酸钠慢性诱导细胞发生EMT。BEAS-2B细胞经亚砷酸钠慢性处理后,细胞相对迁移率升高（P<0.05）,克隆形成数目增多（P<0.01）,E-cadherin表达水平降低（P<0.001）,而Vimentin表达水平增高（P<0.001）。4.亚砷酸钠慢性诱导细胞通过激活MEK/ERK1/2信号通路发生EMT。与BEAS-2B细胞相比,TB2B细胞p-ERK1/2表达升高（P<0.001）。ERK1/2 siRNA降低TB2B细胞Vimentin表达,抑制细胞迁移。与BEAS-2B细胞相比,Snail和ZEB1蛋白显著升高（P<0.001,P<0.01）,但Twist蛋白表达显著下降（P<0.01）,且用qRT-PCR测得ZEB1和Snail mRNA相对表达水平上调（P<0.05,P0.05）。5.抑制自噬可促进EMT且MEK/ERK1/2被进一步激活。巴弗洛霉素处理后,TB2B+Baf A1（10nM）组的细胞迁移能力增强（P<0.01）,细胞克隆数目增多（P<0.01）,p-ERK1/2、ZEB1和Snail表达水平上升（P<0.05,P<0.01,P<0.001）,而E-cadherin表达水平下降（P<0.05）。6.敲除自噬基因Beclin-1可促进EMT。KO组(Beclin-1-/-)的Vimentin、Snail和ZEB1蛋白表达较WT组明显升高（P<0.05,P<0.01,P0.05）,且KO组细胞迁移数量较WT组明显增多（P<0.01）。7.阻断MEK/ERK1/2信号通路,Beclin-1蛋白表达水平无明显变化。U0126处理组的p-ERK1/2蛋白表达较对照组显著下调（P<0.01）,Vimentin和Snail蛋白表达水平较对照组显著下调（P<0.01,P0.05）。结论:1.亚砷酸钠慢性诱导BEAS-2B细胞自噬增强。2.亚砷酸钠慢性诱导BEAS-2B细胞通过激活MEK/ERK1/2信号通路发生EMT。3.抑制自噬可促进EMT。4.自噬通过MEK/ERK1/2信号通路抑制亚砷酸钠慢性诱导的EMT发生。