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目的：研发一种具有抑制新生血管活性的新型多肽，检测其在体外抑制血管内皮细胞增殖、迁移趋化和管腔形成的作用，阐明其在体内抑制角膜和视网膜新生血管的效果，并初步探讨新型多肽抑制视网膜新生血管的作用机制。
方法：(1)采用生物信息学方法从内源性蛋白Kringle结构中筛选出一段由10个氨基酸组成的多肽序列，命名为TKⅡ-10，采用体外固相方法合成，同时打乱TKⅡ-10氨基酸序列合成对照多肽TKⅡ-10S；(2)在体外，分别采用MTS方法、细胞划痕(wound healing)和Transwell小室方法，以及Matrigel管腔形成实验检测TKⅡ-10多肽在1nM～10uM浓度范围内对血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)诱导的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)增殖、迁移趋化和管腔形成的抑制作用，以人源化的抗VEGF重组鼠单克隆抗体Bevacizumab作为阳性对照，TKⅡ-10S多肽作为阴性对照；同时采用MTS方法和TUNEL荧光染色方法检测TKⅡ-10多肽对正常HUVECs细胞活性和凋亡的影响；(3)在体内，分别采用鸡胚尿囊膜(chorioallantoic membrane，CAM)新生血管模型、VEGF诱导C57BL/6J小鼠角膜新生血管动物模型和高氧诱导C57BL/6J小鼠视网膜新生血管动物模型，进一步验证TKⅡ-10多肽对体内新生血管的抑制效果；(4)在高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型中，分别采用real time PCR和westernblot方法检测TKⅡ-10多肽作用后，小鼠视网膜组织中VEGF和色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)mRNA和蛋白表达的变化。
结果：(1)TKⅡ-10多肽的氨基酸组成是RNPDGDAKPW，经体外固相方法合成后，获得纯度>95％的白色粉末，分子量为1155.24d；(2)体外实验部分：在细胞划痕实验中，VEGF(10ng/ml)可以有效诱导HUVECs细胞迁移；与VEGF组比较，TKⅡ-10多肽在1μM和10μM浓度时能够显著抑制VEGF诱导的HUVECs迁移(p<0.01)；TKⅡ-10S多肽对VEGF诱导HUVECs迁移无明显抑制作用(p>0.05)。在Transwell细胞趋化实验中，VEGF(25ng/ml)可以有效诱导HUVECs细胞趋化；与VEGF组比较，TKⅡ-10多肽在1μM和10μM浓度时能够显著抑制VEGF诱导的HUVECs趋化(p<0.01)；TKⅡ-10S多肽对VEGF诱导HUVECs趋化无明显抑制作用(p>0.05)。在Matrigel细胞管腔形成实验中，VEGF(15ng/ml)可以有效诱导HUVECs细胞管腔样结构形成；与VEGF组比较，TKⅡ-10多肽在100nM、1μM和10μM浓度时能够显著抑制VEGF诱导的HUVECs管腔形成(p<0.01)；TKⅡ-10S多肽对VEGF诱导HUVECs管腔形成无明显抑制作用(p>0.05)。在细胞增殖实验中，VEGF(10ng/ml)可以有效诱导HUVECs细胞增殖；与VEGF组比较，TKⅡ-10和 TKⅡ-10S多肽在1nM～10μM浓度范围内对VEGF诱导的HUVECs细胞增殖无明显抑制作用(p>0.05)。在细胞活性实验中，TKⅡ-10多肽在1nM～10μM浓度范围对正常的HUVECs细胞活性无明显影响(p>0.05)。在TUNEL检测细胞凋亡实验中，TKⅡ-10多肽在1nM～10μM浓度范围对正常的HUVECs细胞无明显促凋亡作用(p>0.05)。(3)体内实验部分：在CAM实验中，PBS组滤纸片周围一个直径范围内尿囊膜毛细血管生长良好；与PBS组相比，TKⅡ-10多肽10μg和50μg组滤纸片周围一个直径范围内尿囊膜毛细血管数量显著减少(p<0.01)。TKⅡ-10S多肽50μg组滤纸片周围一个直径范围内尿囊膜毛细血管生长良好，毛细血管数量与PBS组相比无显著性差异(p>0.05)。在多肽抑制VEGF诱导小鼠角膜新生血管实验中，VEGF组小鼠角膜新生血管自角巩缘向缓释颗粒生长浓密，呈毛刷状，迂曲扩张；与VEGF组相比，TKⅡ-10多肽1μg和5μg组角膜新生血管最长血管长度、钟点数以及新生血管面积均明显减小(p<0.05)；TKⅡ-10S多肽5μg组角膜可见明显新生学血管生长，与 VEGF组相比最长血管长度、钟点数以及新生血管面积无显著性差异(p>0.05)。在多肽抑制高氧诱导小鼠视网膜新生血管实验中，与高氧+PBS组相比，高氧+TKⅡ-10多肽组小鼠视网膜新生血管面积、无灌注区范围明显缩小，突出视网膜表面有核细胞数量显著减少(p<0.01)。与高氧+PBS组相比，高氧+TKⅡ-10S多肽组视网膜新生血管面积、无灌注区范围无明显缩小，突出视网膜表面有核细胞数量均未见明显减少(p>0.05)。(4)在TKⅡ-10抑制高氧诱导小鼠视网膜新生血管实验中，与高氧+PBS组相比，高氧+TKⅡ-10多肽治疗组VEGF mRNA和蛋白表达量显著降低(p<0.01)，同时PEDF mRNA和蛋白表达量显著增加(p<0.01)。
结论：(1)在体外，TKⅡ-10多肽能够有效抑制 VEGF诱导的血管内皮细胞迁移趋化和管腔形成，并且其抑制作用具有良好的剂量依赖性和序列依赖性；TKⅡ-10多肽对 VEGF诱导的血管内皮细胞增殖无明显抑制作用；TKⅡ-10多肽对正常血管内皮细胞活性和凋亡无影响；(2)在体内，TKⅡ-10多肽能够有效抑制鸡胚尿囊膜新生血管、VEGF诱导小鼠角膜新生血管和高氧诱导小鼠视网膜新生血管；(3)TKⅡ-10多肽通过下调视网膜组织内 VEGF表达，同时增加PEDF表达的双重调控，恢复血管生长促进因子与抑制因子之间的动态平衡来发挥抑制视网膜新生血管的作用。