鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)是高致病性病毒病疱疹病毒造血器官坏死病(HVHN)的致病病原。近年来,该病毒的爆发给中国异育银鲫养殖业带来了很大的危害,其特点是高致病性、高致死率,因而为防控CyHV-2,建立准确的病毒检测方法、筛选有效的防控药物是必不可少的一环。基于CyHV-2的检测技术已有诸多报道,但在病毒编码的150个基因中对相关的免疫学诊断技术尤其是关于单抗的研究较少,不利于对病毒的早期监控检测。单克隆抗体技术基于抗原抗体相结合具有特异性和专一性的特点,可将其用于构建免疫原性更强的免疫学诊断方法。目前为止,有关抗异育银鲫感染CyHV-2药物的有效性研究仍呈空白之态。中草药应用于中国人类医疗历史悠久,因其兼具营养性及药用性的双重作用受到人们的广泛关注,其成本低廉、药物残留少及副作用小、资源丰富等优势也常应用在水产动物疾病防控。将抗病毒中草药作为防控CyHV-2的研究方向是十分具有潜力的。鲤疱疹病毒Ⅱ型单克隆抗体及抗病毒中草药筛选的研究都对防控CyHV-2具有十分重要的意义。具体研究内容如下:(1)利用本实验室保存的江苏射阳感染CyHV-2的病鱼组织,提取其纯化样品的DNA作为PCR反应的模板,根据ORF92基因(基因登录号:AFJ20521.1)设计引物,基因扩增后克隆至原核表达载体PGEX-4T-3,将对PGEX-4T-3-ORF92重组质粒进行诱导表达纯化,产物进行SDS-PAGE分析,使用纯化的ORF92重组蛋白免疫BaLB/c小鼠成功获得抗ORF92重组蛋白的血清。Western blot实验结果表明,制备的抗CyHV-2-ORF92重组蛋白的多克隆抗体可以特异性识别经原核表达的ORF92重组蛋白,同时也可以识别出CyHV-2病毒粒子上的主要衣壳蛋白ORF92,并利用免疫组织化学技术识别出在感染CyHV-2的肾脏组织中的病毒粒子。(2)通过制备的抗ORF92重组蛋白多克隆抗体实验结果显示ORF92重组蛋白可以作为抗原免疫小鼠使之产生抗ORF92重组蛋白的抗体。我们使用抗原以腹腔注射的方式免疫BaLB/c小鼠四次,最后一次免疫后的第三天取经免疫小鼠的脾脏与SP2/0瘤细胞融合产生新的杂交瘤细胞。对检测结果呈阳性的细胞株亚克隆后获得一株能稳定分泌出抗CyHV-2 ORF92的单克隆抗体,将其命名为1B7。将获得的1B7细胞株扩大培养冻存保藏,使用石蜡致敏小鼠后对其注射1B7细胞0.5×10~7个,使之产生大量的单抗腹水。CyHV-2-ORF92-1B7单克隆抗体的亚型为IGg2b,其抗体效价可达1:50000。对感染CyHV-2的RyuF-2细胞及异育银鲫的肾脏、脾脏、鳃、脑、肌肉、心脏等组织切片,并使用单克隆抗体1B7作为一抗进行免疫荧光检测,成功建立了检测异育银鲫感染CyHV-2的免疫学检测方法。(3)分别制备添加1%穿心莲、黄芪、板蓝根、大黄4种中草药的定制饲料并将其投喂实验组异育银鲫,而后腹腔注射1 mL定量为1.08×10~7拷贝/mL的CyHV-2病毒,研究这4种中草药对异育银鲫感染鲤疱疹病毒Ⅱ型的影响。人工感染后采用实时荧光定量PCR的方法测定血液中的鲤疱疹病毒Ⅱ型的滴度。实验结果显示对照攻毒组鱼体临床症状为胸腹部体表大面积充血,鳃部暗红出血,脾脏肿大、内脏出血等体征,为典型的鲤疱疹病毒Ⅱ型发病症状,且用PCR方法能检测出鲤疱疹病毒Ⅱ型基因组片段。投喂含穿心莲、黄芪、板蓝根、大黄饲料的实验组异育银鲫的死亡率分别为15%、30%、35%、95%,对照组死亡率为100%。对照组血液中的病毒滴度高于穿心莲、板蓝根、黄芪实验组,大黄与对照组病毒滴度差别不大。研究结果表明大黄定制饲料抗鲤疱疹病毒Ⅱ型的效果相对较差,黄芪与板蓝根抗病毒效果稍强,穿心莲具有较好的抗CyHV-2效果,或可作为一种拮抗CyHV-2病毒性疾病的防控药物。