论文部分内容阅读
第一部分经BMP9诱导后C3H10T1/2细胞JNK和ERK5的激活情况目的：检测经高滴度携带GFP和BMP9基因的重组腺病毒转染C3H10T1/2细胞后JNK和ERK5的激活情况。方法：培养HEK293细胞，并用其对AdBMP9和AdGFP进行扩增，提高AdBMP9和AdGFP的滴度。高滴度AdBMP9和AdGFP转染C3H10T1/2细胞24h后，荧光显微镜观察GFP的表达情况并用流式细胞仪检测转染效率，免疫荧光技术定位p-JNK和p-ERK5在细胞内的表达部位，利用CCK-8检测特异性抑制剂对细胞生长情况的影响，Western blot检测加入JNK或ERK5信号通路特异性抑制剂SP600125或BIX02189并转染后JNK和ERK5的激活情况。结果：1.流式细胞仪检测高滴度AdBMP9和AdGFP转染C3H10T1/2细胞24h后的转染效率均可达50%左右。2.倒置显微镜下观察AdBMP9转染后细胞的形态随培养时间的延长由多边形逐渐向长梭形转变，且细胞间链接更加紧密。3.免疫荧光技术结果显示各组细胞的胞质、胞核均可见p-JNK及p-ERK5的表达，但经AdBMP9诱导后p-JNK及p-ERK5的表达明显增强，且表达主要分布于胞核及大部分靠近胞核的胞浆内。4.CCK-8结果显示C3H10T1/2细胞的生存率均随特异性抑制剂浓度的增高而降低，但是实验选择的浓度远远低于IC50，因此其对细胞增殖的抑制作用可忽略不计。5.Western blot结果显示经AdBMP9诱导后p-ERK5和p-JNK的表达均显著增高，而表达又随着特异性抑制剂浓度的升高逐渐降低。结论：利用HEK293细胞扩增得到的高滴度AdBMP9和AdGFP对C3H10T1/2细胞有较高的转染效率；转染后的C3H10T1/2细胞p-ERK5和p-JNK的表达均显著增高，且表达情况又随着抑制剂浓度的升高逐渐降低，15μmol/L BIX02189、20μmol/L SP600125可以阻断经AdBMP9诱导的C3H10T1/2细胞ERK5及JNK的激活。第二部分特异性阻断JNK和ERK5后经BMP9诱导的C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化的情况目的：经AdBMP9诱导的C3H10T1/2细胞在利用JNK特异性抑制剂SP600125和ERK5特异性抑制剂BIX02189阻断后向心肌样细胞分化的情况。方法：利用15μmol/L BIX02189、20μmol/L SP600125阻断ERK5及JNK的激活，RT-qPCR检测经AdBMP9诱导1周时C3H10T1/2细胞心肌特异性基因GATA4、MEF2C表达，Western blot检测经AdBMP9诱导3周时细胞心肌特异性蛋白cTnT和CX43表达，免疫荧光技术定位cTnT、CX43在细胞内的表达。结果：BIX02189抑制ERK5激活后，AdBMP9诱导的C3H10T1/2细胞的心肌分化标志物MEF2C、GATA4、CX43、cTnT均受到显著抑制，JNK特异性抑制剂SP600125也可抑制MEF2C、GATA4、CX43、cTnT表达，但对MEF2C及GATA4的抑制作用不如BIX02189显著。结论：ERK5和JNK的过度激活参与了BMP9诱导的C3H10T1/2细胞向心肌样细胞的分化。