论文部分内容阅读
目的:鸟分枝杆菌是细胞内寄生菌,在艾滋病晚期常可发生鸟分枝杆菌的扩散性感染。鸟分枝杆菌通过呼吸道入侵人体肺泡时,面临诸多不利因素的胁迫,如低pH值及富含表面活性物质等,随后它们进入巨噬细胞内部,又面临氧气缺乏以及大量活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的胁迫,但鸟分枝杆菌可以在感染早期耐受这些不利环境,并在巨噬细胞内存活繁殖。因此研究与此相关耐受基因的功能,不仅能了解鸟分枝杆菌在体内存活的机理,而且能为消灭它们提供思路。本文通过构建鸟分枝杆菌基因组表达文库,利用肺泡的表面活性物质与阴离子去垢剂SDS在物理性质上的相似性,采用生物活性水平的筛选策略,筛选鸟分枝分枝杆菌耐受肺泡表面活性物质相关的基因,探索以此相关基因的功能,以揭示鸟分枝杆菌的致病机理,为今后获得潜在的药物靶标来治疗鸟分枝杆菌病提供新的思路。方法:提取鸟分枝杆菌基因组DNA,用Sau3A I不完全酶切后,与经同尾酶BamH I酶切并去磷酸化处理的pBluescript SK（+）质粒连接,连接产物转化大肠杆菌DH5α而获得基因组文库。通过计算文库滴度、菌落PCR分析克隆子来评价文库质量。利用生物活性水平筛选方法,从鸟分枝杆菌基因组文库中筛选出耐受SDS的克隆子。对所获得的克隆子进行测序,通过NCBI/BLAST结合DNAMAN软件对测序结果进行核酸序列的同源性分析,以获得克隆子的全基因序列。利用生物信息学对目的基因编码蛋白的理化性质、空间结构和功能位点进行分析。以鸟分枝杆菌总DNA为模板,利用PCR扩增克隆子的全基因序列,与表达载体pGEX-4T-3连接后转化大肠杆菌BL21（DE3）,SDS-PAGE检测表达产物。通过平板菌落计数,计算转化菌分别在含SDS、低p H、H2O2和NaNO2的平板上的存活率。结果:成功构建鸟分枝杆菌基因组文库,文库滴度为1.18×104cfu/mL,随机挑选13个菌落进行菌落PCR分析,插入片段大小在250bp-750bp之间,满足文库建立的要求。利用生物活性水平筛选方法,从鸟分枝杆菌基因组文库当中筛选到两个耐受SDS的克隆子,序列分析显示这两个克隆子为MAV-4012和MAV-4292。将MAV-4012和MAV-4292分别与载体pGEX-4T-3连接后转化大肠杆菌,成功构建了过表达MAV-4012和MAV-4292蛋白的转化菌。在体外各种压力条件下,过表达MAV-4012和MAV-4292蛋白均能增强转化菌在表面活性压力SDS条件下的存活,并增强了转化菌在低pH值条件下的存活。过表达MAV-4292蛋白只能增强转化菌在活性氧ROS条件下的存活,而过表达MAV-4012蛋白使转化菌对活性氧ROS和活性氮RNS两种氧化途径都耐受。通过MAV-4012编码蛋白的生物信息学分析,它很可能是一个跨膜蛋白,并具有Geopilin结构域,通过对MAV-4292编码的蛋白序列比对发现该蛋白同其他任何蛋白的序列同源性特异性均不高。结论:从鸟分枝杆菌基因组文库中筛选到两个耐受肺泡表面活性物质的基因MAV-4012和MAV-4292。从预测的理化性质、功能位点及结构特点推断,其表达的蛋白可能成为诊断、治疗或者预防鸟分枝杆菌病的有价值的靶分子。