背景:视网膜色素上皮细胞(Retinal pigment epithelium cells,RPE)通过发挥营养、支持及屏障等关键作用来维持视网膜功能和代谢的稳态。视网膜变性疾病(Retinal Degenerative diseases,RD)的发生,伴随视网膜色素上皮细胞的凋亡和功能障碍[1]。视网膜下腔移植人胚胎干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞(Human Embryonic Stem Cells derived RPE,hESC-RPE)是目前治疗此类疾病的最佳临床策略之一[2,3]。大量动物和临床实验证实,hESC-RPE的移植对于视网膜变性疾病有明确的短期疗效,是良好的种子细胞[4],既往研究报道,超过百分之95的治疗细胞移植后主要是通过细胞间物质交换,自分泌、旁分泌机制发挥免疫调节作用[5]。外泌体作为一种几乎所有活细胞都可产生的纳米级囊泡,分泌出胞后可在全身循环中传递,其内部搭载有蛋白质、核酸及脂质等物质[6],通过将上述生物活性分子传递给靶细胞从而改变靶细胞的行为和状态[7,8]。作为移植后细胞间物质交换和信息传递的重要载体,现阶段对hESC-RPE衍生的外泌体在变性视网膜中的作用尚不明晰。除此之外,由于患者血-视网膜屏障的损坏[9],移植后的细胞将长期浸润在炎症环境中,移植细胞在受到炎症因子刺激后,其分泌的外泌体所搭载的货物会发生显著改变[10],发挥的作用也将随之变化。因此,探索hESC-RPE在不同病理生理状态下所分泌外泌体的内含物和功能的差异,为明确临床上干细胞移植的有效性机制,加快干细胞移植的临床转化有重要意义。本研究假设:外泌体可能是hESC-RPE移植后发挥功能的重要途径之一,处于不同炎症微环境的hESC-RPE所分泌的外泌体可能发挥不同的功能,一方面正常培养的hESC-RPE所衍生的外泌体(Normal hESC-RPE derived exosomes,后称Nor-EXO)可能通过调节视网膜内免疫细胞的激活在一定程度上缓解变性视网膜的局部炎症;另一方面受到IFN-γ等炎症因子刺激的hESC-RPE所分泌的外泌体(IFN-γ stimulated hESC-RPE derived Exosomes,后称IFN-γ EXO)可能通过进一步刺激机体免疫细胞增殖激活,恶化视网膜变性炎症微环境。研究目的:本课题旨在探究受到或不受到视网膜变性炎症微环境刺激的hESC-RPE所分泌的外泌体在内含物及功能上的差异,及外泌体参与调控视网膜变性炎症微环境的机制。研究方法:第一部分:Nor-EXO参与视网膜变性疾病炎症微环境调控及其机制研究1.通过差速离心法分离提取hESC-RPE衍生的外泌体并利用透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)、蛋白质印迹(Western Blot,WB)和纳米粒度追踪(Nanosight analysis,NTA)对其进行鉴定。2.向变性早期(d21)RCS大鼠视网膜下腔移植外泌体,以PBS作为对照,通过闪光视网膜电图(Flash Electroretinogram,f-ERG)、光栅行为学等手段检测外泌体移植对RCS大鼠视功能的影响;通过免疫荧光技术及q-PCR(Quantitative Real-time PCR,q-PCR)技术,检测外泌体移植对RCS大鼠视网膜中小胶质细胞的影响。3.通过蛋白组高通量测序探索正常培养的hESC-RPE衍生的外泌体(Normal hESC-RPE derived exosomes,后称Nor-EXO)内部具体搭载的蛋白货物,并借助String、GO等多数据库联合分析挖掘其发挥功能的关键通路。4.将外泌体与RCS大鼠视网膜外植体共培养,通过细胞因子芯片、q-PCR等手段探索Nor-EXO对变性视网膜中促炎细胞因子及小胶质细胞相关细胞因子的影响。5.借助小胶质细胞系BV-2探索Nor-EXO参与调节变性视网膜的具体机制。第二部分:IFN-γ EXO参与视网膜变性疾病炎症微环境调控及其机制研究1.使用IFN-γ预处理hESC-RPE模拟体内视网膜变性炎症微环境;差速离心法分离纯化正常培养的hESC-RPE外泌体(Nor-EXO)及IFN-γ刺激后hESC-RPE分泌的外泌体(IFN-γ stimulated hESC-RPE derived EXO,后称 IFN-γ EXO),通过WB、NTA、TEM等手段对两种外泌体进行鉴定。2.在RCS大鼠的视网膜变性的早、中、晚期分别向其视网膜下腔移植两种不同种类外泌体,通过f-ERG等手段检测移植后RCS大鼠视功能变化,并通过流式细胞术和q-PCR,检测不同外泌体在体内对免疫细胞比例及相关促炎细胞因子表达水平的影响。3.利用高通量蛋白组测序检测Nor-EXO及IFN-γ EXO内部搭载蛋白货物差异,并借助GO、KEGG、Uniprot等多数据库联合分析,挖掘富集免疫相关通路,预测功能差异。4.在体外将hESC-RPE与两种外泌体共培养,通过流式细胞术和实时q-PCR表征不同外泌体对hESC-RPE免疫原性、活性、功能及对免疫细胞趋化能力的影响。5.通过羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluorescein succinimidyl amino ester,CFSE)、固相酶联免疫斑点技术(ELISPOT)、流式细胞术等手段表征两种不同外泌体对视网膜变性患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中自然杀伤细胞(Natural killer cells,NK cells)、CD8+细胞毒性T细胞的比例(CD8+Cytotoxicity Tcells,CD8+T cells)、增殖及效应物颗粒酶B(Granzyme B)的分泌差异。研究结果:第一部分:Nor-EXO参与视网膜变性疾病炎症微环境调控及其机制研究1.捕获hESC-RPE分泌的外泌体(后称Nor-EXO),电镜下呈经典双凹茶托样结构,NTA检测平均直径为119.7nm,表达CD63、CD81、TSG101等外泌体标志蛋白,表明差速离心法能够获得较为纯净的外泌体。2.相较于PBS移植组,将Nor-EXO移植入RCS大鼠的视网膜下腔后,RCS大鼠视功能得到保留,闪光视网膜电图b波幅值(p<0.05)和视敏度(p<0.05)显著增高,提示Nor-EXO移植延缓RCS大鼠视功能丢失;3.免疫荧光显示RCS大鼠Nor-EXO移植组视网膜中小胶质细胞形态多为静息态“分支状”,而PBS移植组多为激活态“阿米巴样”;且Nor-EXO移植组视网膜中IFN-γ、CCL-2等小胶质细胞相关促炎细胞因子表达水平显著更低(p<0.05),表明Nor-EXO移植减缓RCS大鼠视网膜中小胶质细胞介导的炎症反应。4.通过高通量蛋白组测序发现Nor-EXO内部搭载蛋白质主要富集到的免疫学相关生物学通路是:Negative regulation of acute inflammatory response(q<0.05)。5.细胞因子芯片显示,与Nor-EXO共培养显著降低RCS大鼠视网膜外植体中IL-1α、IL-1β、sICAM-1等促炎细胞因子的表达水平(p<0.05);q-PCR结果提示Nor-EXO显著下调激活的小胶质细胞标志物CD68等在转录水平的表达(p<0.05);表明Nor-EXO通过下调激活的小胶质细胞数目降低RCS大鼠视网膜外植体中促炎细胞因子水平。6.Nor-EXO与经由LPS刺激后的BV-2小胶质细胞系共培养后,流式细胞术显示M1型小胶质细胞标志物CD86表达水平显著降低(p<0.01);q-PCR结果同样显示IL-6、iNOS等激活的M1型小胶质细胞相关炎症因子表达水平显著降低(p<0.05),而Arg-1、IL-10等调节性细胞因子表达水平上调(p<0.01),提示Nor-EXO通过减少M1型小胶质细胞数目来抑制促炎细胞因子的分泌,进而改善变性视网膜炎症微环境。第二部分:IFN-γ EXO参与视网膜变性疾病炎症微环境调控及其机制研究1.IFN-γ刺激hESC-RPE 24h后,流式细胞术显示hESC-RPE表面HLA抗原表达水平升高,提示成功构建视网膜变性炎症微环境中高免疫原性hESC-RPE模型。2.捕获IFN-γ刺激后hESC-RPE衍生的外泌体(后称IFN-γ EXO),电镜下观察呈双层膜样结构,NTA检测外泌体平均直径为123.4nm,表达CD63、CD81、TSG101等外泌体标志蛋白,提示Nor-EXO和IFN-γ EXO在形态结构及粒径方面没有显著差异。3.在RCS大鼠的视网膜变性的早、中、晚期分别向其视网膜下腔移植Nor-EXO或IFN-γ EXO,f-ERG结果显示三个时间点IFN-γ EXO的移植均导致RCS大鼠fERG b波幅值快速丢失(p<0.05),而Nor-EXO则在RCS变性的早、中期较为显著的保留b波幅值(p<0.05),提示Nor-EXO移植能够在一定程度上保护RCS大鼠的残存视力,但其保护作用随着变性程度的加深而减弱,而IFN-γ EXO无论是在变性的早期、中期或是晚期移植均将导致RCS大鼠视觉功能进一步丢失。4.流式细胞术结果显示,IFN-y EXO移植后显著增加RCS大鼠变性视网膜中NK细胞及CD8+T细胞的比例(p<0.01),而Nor-EXO在一定程度上减少了 NK细胞比例(p<0.05),对CD8+T细胞影响不显著;q-PCR结果提示IFN-γ EXO显著上调RCS大鼠视网膜中CCL-2、CCL-5、CXCL9等趋化因子表达水平(p<0.05),而Nor-EXO除能显著降低CCL-2表达水平外(p<0.05),对其趋化因子几乎没有影响,提示IFN-γEXO通过趋化募集NK细胞和CD8+T细胞,导致RCS大鼠视网膜炎症反应增强,改变其视网膜炎症微环境。5.通过对Nor-EXO及IFN-γ EXO的蛋白组测序数据进行分析,共检测到428个差异表达蛋白,进一步利用多数据库联合分析,发现IFN-γ EXO中MHC Ⅰ类抗原呈递、白细胞迁移、细胞因子介导的免疫反应等通路显著上调(q<0.05),结果提示IFN-γ EXO可能通过增强MHC抗原的呈递引起NK细胞及CD8+T细胞的募集激活,导致促炎细胞因子释放增加,增强视网膜内炎症反应。6.将前述两种外泌体与hESC-RPE共培养48h后,通过流式细胞术发现IFN-γEXO显著上调hESC-RPE表面HLA抗原表达水平(p<0.01),流式细胞术及q-PCR结果提示 IFN-γ EXO 促进 hESC-RPE 凋亡(p<0.01),降低 RPE65,PEDF、bestrophin等功能基因的表达(p<0.05),并增加CCL-2,CCL5,CXCL-9等趋化因子在转录水平的表达(p<0.05),而Nor-EXO组则对hESC-RPE无显著影响,以上结果提示IFN-γ EXO上调hESC-RPE表面HLA抗原的表达,诱导hESC-RPE凋亡、下调功能基因表达水平并上调hESC-RPE对免疫效应细胞的趋化能力。7.将前述两种外泌体与视网膜变性(RD)患者的PBMC共培养48h后,流式细胞术结果提示IFN-γ EXO显著提高RD患者PBMC中NK和CD8+T细胞的比例(p<0.01),同时增强NK细胞的增殖(p<0.05);ELISPOT结果显示IFN-γ EXO显著促进NK细胞与CD8+T细胞的激活及其细胞毒性效应物GranzymeB的分泌(p<0.01),而Nor-EXO则对GranzymeB的分泌有一定的抑制作用(p<0.05),以上结果证明了,与Nor-EXO起到的缓解炎症作用相反,IFN-γ EXO通过激活两种免疫效应细胞,诱导免疫效应物的分泌从而恶化移植细胞所处炎症微环境,上述发现为细胞水平及整体水平的实验结果提供了有力支撑。结论:本研究选用经典的视网膜变性疾病模型鼠RCS大鼠,在不同阶段向其视网膜下腔移植两种不同的外泌体,并结合高通量蛋白组测序、外植体培养及Elispot等手段,探索了外泌体对视网膜变性炎症微环境的作用及调控机制。1.本研究借助RCS大鼠模型首次观察到Nor-EXO移植后通过缓解在体小胶质细胞的激活,抑制相关炎症因子分泌从而挽救视功能;而IFN-γ EXO则在移植后显著上调了变性视网膜中NK细胞及CD8+T的比例,从而导致RCS大鼠视功能迅速丢失。2.本研究率先通过高通量蛋白组学对Nor-EXO及IFN-γ EXO内部搭载蛋白进行了测序对比,发现Nor-EXO上调蛋白主要富集在抑制急性炎症等通路上,而IFN-γ EXO上调蛋白则主要富集在增强抗原呈递、促进炎症因子释放等通路上。3.本研究利用了视网膜外植体培养技术,在离体组织水平上证实了 Nor-EXO显著降低RCS大鼠变性视网膜中CCL-2为代表的一系列炎症因子表达水平;同时借助BV-2小胶质细胞系,发现Nor-EXO通过抑制激活的M1型小胶质细胞数量,从而减少相关细胞因子的表达水平,明确了 Nor-EXO对激活小胶质细胞介导炎症的抑制,是限制变性视网膜炎症微环境进一步恶化的重要机制,以上结果尚未见文献报道。4.本研究观察到,IFN-γ EXO与hESC-RPE共培养后将显著上调细胞表面HLA抗原的表达水平,恶化hESC-RPE的存活及功能相关基因的表达,并上调对免疫细胞的趋化能力。5.本研究创新性的将视网膜变性患者PBMC与外泌体的共培养体系和Elispot这一可视半定量实验结合,率先发现与Nor-EXO起到的抑制作用相反,与IFN-γEXO共培养将显著增加PBMC中NK细胞和CD8+T细胞的比例、增殖及激活后效应物GranzymeB的释放,进一步恶化变性视网膜微环境,以上结果为干细胞治疗视网膜变性疾病的有效性机制研究提供了新的思路。