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旋毛虫排泄分泌抗原（excretory-secretory antigen，ES抗原），是一类由旋毛虫虫体分泌排泄而产生，可以进入宿主机体，直接暴露于宿主免疫系统，诱导宿主产生免疫反应的抗原物质。可用于疾病诊断、疫苗以及免疫机制等方面的研究。Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）家族具有模式识别受体的功能，通过识别病原体的病原相关分子模式（pathogen-associatedmolecular patterns, PAMPs），也称为TLRs的配体或激动剂，构成了机体抗感染的第一道防线，在固有免疫中起着重要作用。TLRs能识别多种抗原，如内源性的热休克蛋白，及多种外源性抗原。HSP70是一类最保守的热休克蛋白，具有较强的免疫原性。本研究采用体外培养旋毛虫肌幼虫方法制备ＥＳ抗原，用于免疫小鼠制备单克隆抗体，经过三轮筛选筛，得到2株稳定分泌抗旋毛虫肌幼虫ES抗原抗体的杂交瘤细胞株，２株细胞分泌抗体亚型均属于IgG类。选取其中A11细胞株制备腹水并纯化，纯化后腹水效价为1：2.1×105，纯化后单抗浓度为3.8mg／ml。 Western Blot结果显示单抗A11可识别ES抗原中43、49、53kDa三条蛋白带。用ES抗原免疫家兔制备兔抗ES抗原多抗并纯化，纯化后血清效价为1：1.2×106，纯化后多抗血清蛋白浓度为8.8mg／ml。用单克隆抗体作为捕获抗体，以多抗为检测抗体，建立了双抗体夹心ELISA检测方法。经方阵法确定单抗最佳工作浓度为7.6μl／ml（1：500），多抗浓度为4.4μl／ml（1：2000）。该检测方法对常见寄生虫抗原如日本血吸虫、弓形虫、猪鞭虫、猪囊尾蚴、猪蛔虫、华枝睾吸虫、捻转血矛线虫、前后盘吸虫均无交叉反应。本方法对ES抗原最小检出量为12ng／ml。检测肌幼虫24h培养液上清，5蚴／ml即可检测出ES抗原。将虫体进行超声破碎检出量为0.25蚴／ml。通过对感染旋毛虫小鼠不同时间血清进行检测，在感染后7d即可检测出循环抗原。利用制备的单抗A11结合免疫亲和层析法，对旋毛虫肌幼虫ES抗原进行提纯，之后进行SDS-PAGE分析，可见分子量大小约为43、49、53kDa的三条混合蛋白带，混合蛋白浓度为0.34mg／ml。根据GenBank中登录的TLR2、TLR4序列，设计并合成引物，采用RT-PCR方法从小鼠巨噬细胞cDNA中扩增TOLL样受体2（mTLR2）和TOLL样受体4（mTLR4）基因，得到基因全长CDS，经克隆测序正确后分别构建真核表达质粒pcDNA3.1-mTLR2和pcDNA3.1-mTLR4。重组质粒瞬时转染HEK293T细胞，用RT-PCR与免疫荧光检测其表达及细胞定位，结果显示mTLR2转染后成功表达并定位于细胞膜。利用TLR2激活物pam3csk4和TLR4激活物LPS分别刺激转染重组质粒的HEK293T细胞后，用双荧光素酶报告基因系统分析其下游转录因子NF-κB的转录活性，结果经刺激后TLR2和TLR4荧光素酶活性显著高于生理盐水对照组，说明表达的mTLR2和mTLR4具有野生型分子的功能。分别取三种旋毛虫抗原：旋毛虫ES抗原、经单抗亲和纯化得到的43、49、53kDa混合蛋白及原核表达的旋毛虫HSP70蛋白，分别加入转染了mTLR2或mTLR4的HEK293T细胞。结果显示：旋毛虫ES抗原和经单抗纯化得到的43、49、53kDa混合蛋白都与mTLR2和mTLR4受体直接作用，激活下游NF-κB通路，原核表达的旋毛虫HSP70蛋白则仅能激活mTLR2受体的NF-κB通路。不与mTLR4发生反应。本研究为旋毛虫病的预防诊断、免疫及致病机理的研究奠定了基础。