目的随着临床治疗念珠菌性外阴阴道炎唑类药物的运用,其唑类药物耐药发生率也越来越高,氟康唑对于白念珠菌发生作用在于药物进入细胞内作用于相关基因或与一些关键酶结合而起到抑制作用;其耐药性的产生也是由于相关耐药基因表达或变异所致;患者病情缠绵难愈,已经引起广泛的重视;如何降低患者对哗类药物的耐药性,或者开发出治疗复发性念珠菌性外阴阴道炎的新方法、新药物,减轻患者痛苦,已是广大医药工作者面临的重大问题。研究发现,临床上中医中药治疗对于初发或是复发性念珠菌性外阴阴道炎效果良好,可以明显改善患者痛苦;根据以前的研究,中药香莲外洗液外洗治疗念珠菌性外阴阴道炎或复发性念珠菌性外阴阴道炎疗效显著,对阴道白念珠菌有明显的抑制作用。白念珠菌对唑类药物的耐药研究在现代分子生物学技术的指引下已经进入分子水平,并且在不断的发展中,国外现在已经定位到专门的耐药基因上,并对专门的耐药基因进行多方位的研究;国内的研究目前基本上着重于药物作用的基因的整体的研究,从整体上来阐述耐药的实质。本研究的创新点主要主要是借鉴现代分子生物学技术,在基因水平上揭示香莲外洗液对白念珠菌作用的分子机制,包括白念珠菌的敏感株和耐药株,揭示香莲外洗液的作用机理,分析不同菌株在外洗液作用下的基因表达差异,利用基因分析相关技术对中药外洗方作用的菌株进行多靶点超高通量筛选,构建香莲外洗液基因作用机制;中药治疗念珠菌病效果良好,但是其具体的作用机理是什么,同氟康唑一样有同样的作用机理,还是有自己的特异性未揭示的靶点;对于反复发作的念珠菌病,中药外用也有良效,那么对于耐药念珠菌株,其在分子作用水平上的机理又是什么呢?值得我们好好的研究,为中药制剂的规范化提供佐证;由此对中药的研究与开发及走向世界具有实际意义。方法1氟康唑诱导SC5314标准菌株为短期耐药株,观察诱导后和诱导前的基因差异表达。运用基因芯片对氟康唑诱导短期耐药的基因与原代菌株进行比较分析,在基因层面上了解耐药性的形成。2香莲外洗液作用于氟康唑诱导的SC5314短期耐药株,观察香莲外洗液作用前和作用后的相同差异基因表达。对香莲外洗液作用于氟康唑诱导的SC5314短期耐药株的基因变化与氟康唑诱导原代菌株至耐药菌株的基因表达变化进行比对,找出共同的差异表达基因,由此揭开香莲外洗液作用的特殊靶点并进行详细分析。3香莲外洗液作用于实验室诱导耐药菌株和临床耐药株后相同基因差异基因表达分析。对香莲外洗液作用的氟康唑诱导的短期耐药菌株和临床耐药菌株差异基因进行比对,找出共同的差异表达基因,由此揭开香莲外洗液作用的特殊靶点并进行详细分析。4对NCCLS的M27-A3、S3的MIC观测方法与葡萄糖消耗试验测量的MIC方法进行一致性研究。采用葡萄糖消耗试验测量香莲外洗液作用的菌株的MIC。结果1由氟康唑对三种菌株MIC测定结果可知,香莲外洗液作用于试验菌株SC5314其MIC为0.4883mg/ml。氟康唑作用于SC5314的MIC为0.25μg/ml,初步推断在体外抑菌白念珠菌SC5314试验中,香莲外洗液0.4883mg/ml和氟康唑0.25μg/ml效力相当。留待以后研究确证。2随着香莲外洗液的浓度上升,试验的两种菌株各孔葡萄糖浓度越高,说明葡萄糖消耗越少,经过药物浓度取对数后进行分析,发现取对数后的药物浓度和每孔中葡萄糖浓度者呈现线性关系;对香莲外洗液作用下的两种菌株的线性关系进行分析比较,发现香莲外洗液对两种菌株作用具有一致性。随着氟康唑药液的浓度上升,试验的两种菌株各孔葡萄糖浓度越高,说明葡萄糖消耗越少,经过药物浓度取对数后进行分析,发现取对数后的药物浓度和每孔中葡萄糖浓度者呈现线性关系;对氟康唑作用下的两种菌株的线性关系进行分析比较,发现对两种菌株作用具有不一致性。3氟康唑诱导的耐药SC5314菌株与诱导前的敏感株相比,其差异基因表达主要集中在:编码蛋白酶体及蛋白水解酶的基因,编码糖脂代谢过程中相关蛋白的基因,细胞周期相关基因,转录及翻译调节相关基因,应激反应相关基因,线粒体相关基因,细胞壁功能相关基因。4白念珠菌SC5314诱导耐药株经香莲外洗液作用后,其表达变化的基因主要是:编码应激反应家族蛋白的基因,生物膜相关性基因,编码蛋白酶体基因一族,编码细胞周期相关蛋白基因,转录及翻译调节的相关蛋白基因。5白念珠菌临床耐药菌株经香莲外洗液作用后,其表达变化的基因主要是:编码热休克蛋白基因,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因,蛋白酶体家族基因,调控转录及翻译基因。结论由氟康唑对三种菌株MIC测定结果可知,质量控制菌株ATCC22019和TCC6258经过两次重复试验,与生长对照孔进行比较;其结果均落在CLSI推荐的M27—S3 24小时标准范围内,从结果来看,质控菌株对氟康唑敏感性均在控,说明试验条件、操作等均符合要求。因此氟康唑对于SC5314的MIC为0.25μg/ml其结论是可信的。香莲外洗液和氟康唑不同,对于氟康唑,由于它是治疗念珠菌感染的常用的西药,在世界范围内有广泛的临床运用,对于念珠菌(酵母菌)MIC的测定在国际上有深入的研究,氟康唑作用于念珠菌的MIC经过系统的研究有一个系统的范围(标准)可以供我们参考。而香莲外洗液则不同,作为一种医院自制外用药剂,虽然其开发运用超过10,但是也仅是局限于本院使用,对于香莲外洗液作用于念珠菌的系统的MIC的研究尚未启动,因此也谈不上有香莲外洗液作用于念珠菌的MIC可供参照的标准。因此,试验对香莲外洗液作用于念珠菌的MIC测定也进行了初步的探索,为以后的研究打开思路。试验中,香莲外洗液作用于试验菌株SC5314其MIC为0.4883mg/ml。氟康唑作用于SC5314的MIC为0.25μg/ml,基本可以推断在体外抑菌白念珠菌SC5314试验中,香莲外洗液0.4883mg/ml和氟康唑0.25μg/ml效力相当。香莲外洗液和氟康唑对念珠菌葡萄糖消耗的影响与分析研究发现随着香莲外洗液的浓度上升,试验的两种菌株各孔葡萄糖浓度越高,说明葡萄糖消耗越少,经过药物浓度取对数后进行分析,发现取对数后的药物浓度和每孔中葡萄糖浓度者呈现线性关系;对香莲外洗液作用下的两种菌株的线性关系进行分析比较,发现香莲外洗液对两种菌株作用具有一致性。随着氟康唑药液的浓度上升,试验的两种菌株各孔葡萄糖浓度越高,说明葡萄糖消耗越少,经过药物浓度取对数后进行分析,发现取对数后的药物浓度和每孔中葡萄糖浓度者呈现线性关系;对氟康唑作用下的两种菌株的线性关系进行分析比较,发现对两种菌株作用具有不一致性。这可能说明两种药物的作用机制不一样,氟康唑主要作用于细胞色素P450固醇合成酶途径,而香莲外洗液作用于什么途径却不得而知;这也许就是香莲外洗液和氟康唑作用的不同之处,有待于以后进一步研究。对氟康唑诱导的耐药SC5314菌株与诱导前的敏感株进行基因芯片研究发现,其差异基因表达主要集中在:编码蛋白酶体及蛋白水解酶的基因,编码糖脂代谢过程中相关蛋白的基因,细胞周期相关基因,转录及翻译调节相关基因,应激反应相关基因,线粒体相关基因,细胞壁功能相关基因;显然与以往研究中报导的耐药基因的表达差异较大,通过实验发现氟康唑诱导SC5314由敏感株到耐药菌株的过程中,基因表达差异较大的是转录及翻译、代谢、蛋白酶体的基因;细胞耐药性的形成是多个基因共同作用,并且可能作用方式不同而导致的,可能不是几个单一的基因导致了耐药性的形成,有待于以后进一步的研究。耐药前后及香莲外洗液处理前后变化的是编码应激反应家族蛋白的基因:HSP30,HSP60,TIF51.3;RPT3,RPT5,HCT5.3eoc,UBP6.3属于编码蛋白酶体基因一族,及CDC1,CGR1,CCN1属于编码细胞周期相关蛋白基因,PPR1,SWI1,MEF2,TUF1,TIF3基因编码涉及转录及翻译调节的相关蛋白;总体上说明香莲外洗液作用的基因主要还是和细胞应激相关基因,公认的耐药基因受到影响较小。对不同模式的香莲外洗液处理的耐药菌株研究发现,受影响的基因主要是编码热休克蛋白基因SSB1、MGE1,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因,编码KNS1、RPS13.3、RPS22、PUP2、YST1.exon2、RPL10E及RPL28.3f于蛋白酶体家族基因,编码负责调控转录及翻译基因PRT1、IPF776、GCD11、CAP1、TIF35、CAM1.exon2、EFT2、EFT3。对于香莲外洗液作用于氟康唑诱导耐药菌株和临床耐药菌株后基因表达的研究表明,香莲外洗液作用后,白念珠菌从由应激回复稳定状态,如当白念珠菌处于耐药状态时,热休克蛋白表达升高,香莲外洗液作用后热休克蛋白表达降低;香莲外洗液作用于菌株后能恢复细胞正常功能,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性恢复正常。同时改善细胞载荷,当细胞处于耐药状态时,细胞内部蛋白酶体家族功能增强,降解相关蛋白质,促进细胞对外环境的适应性,香莲外洗液作用后,细胞内环境稳定,应激反应相关蛋白质减少,蛋白酶体相关基因表达水平降低。当然最为关键的是香莲外洗液能改善耐药相关基因的表达,恢复细胞的敏感性。本研究主要发现菌株的耐药是一个多基因涉及的复杂的过程,并不是几个单一基因作用的结果,本研究中,公认的耐药基因未发现表达差异,涉及细胞耐药性形成的基因以及香莲外洗液作用的靶点在近年来的文献中均未发现类似报导;也许中药有其自身独特的作用靶点;总之,在本实验中香莲外洗液体现出其独特的优势,不论是抑制念珠菌的生长方面,还是基因靶点方面,均和以往文献结果不同,值得以后详细的研究。