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天然橡胶是产胶植物的一种次生代谢物，它具有耐高温、高弹性等突出优点，是合成橡胶不可比拟的一种世界性工业原料和重要的战略物质，具有极高的经济价值及应用前景。虽然我国是世界第五大天然橡胶生产国，但是自产的天然橡胶远远不能满足国内的需求，有一半以上需要进口来弥补。天然橡胶主要来源于大戟科的巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)，该植物因经济寿命长，易栽培采割，胶质好，产胶量多而得以广泛种植。目前有关巴西橡胶树形态、产胶生理及栽培学等方面的研究已取得了较大的进展，产胶量也达到了一定的水平。但随着对天然橡胶需求的日益增长，如何进一步提高橡胶树的产量已成为天然橡胶行业亟待解决的重大课题，在传统的技术与方法基础上，急待探索新的途径。 二十世纪以来，分子生物学及生物技术的迅猛发展，为农业、医药等生命科学研究带来了划时代的变革。但与其它农作物相比，橡胶分子生物学方面的研究仍相当滞后，研究力量薄弱，所报导克隆的cDNA大都用异源同类基因从橡胶树构建的cDNA文库钓取，从橡胶树克隆的新的基因不多。有关胶乳再生(橡胶生物合成)的分子机制仍不清楚，特别是有关橡胶转移酶(橡胶生物合成关键酶)基因的克隆及其调控的研究都还有待进一步深入。 胶乳里存在着特异表达的基因，它们与胶乳再生(橡胶生物合成)和植物抗逆等密切相关。分离与克隆这些特异表达基因对于进一步阐明胶乳再生(橡胶生物合成)的分子机制具有重要的意义，同时还为橡胶树转基因高产抗逆育种的研究提供材料和理论基础。此外橡胶树的乳管系统又是一种得天独厚的植物生物反应器，采用生物技术，利用橡胶树乳管里的胶乳大量生产外源产物如PHB(生物可降解塑料)等，可大幅度增加橡胶树种植的附加值。因此，在前人研究的基础上，分离与克隆胶乳特异表达基因、揭示乳管中胶乳再生的分子机制，无论对提高天然橡胶的产量还是对建立橡胶树生物反应器的研究，均为至关重要。 本研究以分离与克隆胶乳特异表达基因为目标，利用SSH技术构建了胶乳特异表达基因差减cDNA文库，分离到一批与橡胶树胶乳特异表达相关的基因片段，获得了4个全长cDNA序列及1个cDNA长片段，其中4个在橡胶树中为首次克隆。表达分析结果表明，所克隆的基因中与脂质运输及代谢有关的R291基因的表达不受割胶和排胶影响，而受乙烯诱导过量表达;与橡胶生物合成相关的R363基因不为乙烯诱导，而为排胶所诱导。从而提示，乙烯促进橡胶增产的原因不是直接通过影响橡胶的生物合成，而是通过影响橡胶树的生理代谢来进行的，这为阐明乙烯增产的分子机制提供了实验数据。上述研究结果为进一步了解橡胶树胶乳再生的分子机理、橡胶树生理、转基因高产育种及生物反应器的研究在基因水平上提供了重要的理论依据与研究材料，结果概述如下: 1.利用SSH技术构建了巴西橡胶树常割树胶乳特异表达基因差减cDNA文库，并对所获特异克隆进行了分析。据报导，胶乳里存在着基因的特异表达，而这些特异的基因与胶乳再生有密切的关系。因此本研究采用刚结束排胶常割树胶乳的Poly(A勺胭A为Tester，其叶片Po1y(A+)RNA为Driver，进行抑制消减杂交(SSH)，由此获得的差减cDNA文库经Reverse NOnhem Blot和Northem Bfot进一步剔除假阳性片段后，获得了79个阳性克隆。随机挑取18个阳性克隆进行测序，通过Blast进行比较分析，结果表明有7个克隆在橡胶生物合成中有积极的作用，6个克隆与物质代谢运输、信号传导和形态建成等密切相关，5个克隆在GenBank中均未发现显著相关的同源序列，推测它们可能是功能未知的新基因，或是靠近3’一末端的基因片段，因保守性较低，难以通过同源比较推测功能。 2.通过RACE技术获得了R28、R329、R295、R363等4个全长eDNA序列及一个cDNA长片段。它们与橡胶生物合成、信号传导和物质代谢与运输等相关，可能在胶乳再生过程中起着积极的作用。 R28(GenBank accession AY461413)全长eDNA序列长1365bp，编码区长度1 149bp，由其推导的蛋白质为382aa。功能预测该基因可能是酞基辅酶A还原酶基因家族的成员，它可能和脂质代谢有关。为了进一步确定该基因的相关酶活性，克隆了该基因的编码区，目前正在进行原核表达研究。 R329(GenBank aceession AY461412)全长eDNA序FIJ长788bp，编码区长度435bp，由其推导的蛋白质为144aa。功能预测该基因可能是一个微管相关蛋白的亚单位，它可能与细胞运动和细胞内物质运输，或与感受转导外界信号的刺激有关。 R295(GenBank aceession AY6o593o)全长cDNA序列长lo70bp，编码区长度60Obp，由其推导的蛋白质为1 99aa。序列比较发现它与NTGPI有同源性，可能是一种与膜泡运输相关的特殊的SNAREs。 R291(GenBank aceession AY589690)eDNA序列长982bp，它与拟南芥的磷酸甘油酷转移蛋白家族有同源性。Northem blot分析结果表明，R291在叶片、未割树的胶乳和常割树的胶乳中均无杂交信号，而在乙烯处理的常割树的胶乳中有杂交信号。推测它可能与乙烯刺激反应有关。 R363(GenBank aceession AY461414)全长序列长度1 156bp