目的:进入21世纪之后,人口老龄化是世界面临的主要问题。肾脏作为最快的衰老器官之一,其衰老的特征是肾皮质、肾小球硬化,间质纤维化,肾小管萎缩和动脉硬化。除生理性衰老外,许多慢性疾病可以加速促进肾脏衰老,这些疾病可能诱发肾脏氧化应激、DNA损伤和线粒体损伤等。因此探讨衰老的发生及进展机制有助于为防治衰老找到新的思路和方向。研究发现细胞衰老广泛参与多种疾病的发生发展过程,并且自噬与衰老也密切相关。肾脏细胞的衰老主要影响人肾小球系膜细胞（human glomerular mesangial cells,HGMC）和肾小管上皮细胞。信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）是转录因子 STAT 蛋白家族的成员。一些研究表明,调节STAT3活性在延缓细胞衰老中起重要作用,且STAT3可通过调控自噬缓解衰老。自噬过程中,p62与泛素蛋白和LC3Ⅱ在细胞质中形成复合物,并在自噬溶酶体中降解。因此,p62是反映自噬活性的标记蛋白。p53是一种肿瘤抑制因子,参与调节细胞周期,诱导细胞衰老和凋亡。最近研究表明,p53在肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSC）的衰老过程中起重要作用。作为p53的下游靶基因,当细胞DNA受损时,细胞周期抑制剂p21被激活。它与细胞周期蛋白-CDK复合物紧密结合,诱导细胞周期停滞并抑制细胞增殖。据此,我们推测STAT3/p62/p53/p21可能参与肾脏衰老。普罗布考（Probucol,PRO）化学名丙丁酚,具有降血脂抗氧化作用,可以通过增强糖尿病大鼠肾脏抗氧化能力,延缓糖尿病肾病的发生发展,从而起到肾脏保护作用。氯沙坦（Losartan,LOS）是一种非肽类血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂,可通过拮抗AT1受体起到肾脏保护作用。有研究发现,PRO、LOS都可延缓HGMC衰老,并与降低STAT蛋白的磷酸化密切相关。二甲双胍（Metformin,MET）是目前治疗2型糖尿病的一线药物,其可有效降低肝脏糖异生,减少肠道葡萄糖吸收并增加外周组织的胰岛素敏感性等。有研究发现二甲双胍可以对抗糖尿病条件下的晚期糖基化终产物的积累、氧化应激和炎症。我们采用链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）注射制造糖尿病大鼠模型用以研究肾脏衰老。STZ对胰岛β细胞有选择性破坏作用,可造成外周组织对胰岛素不敏感,诱发动物产生糖尿病。肾小球系膜细胞（HGMC）是肾脏主要的固有细胞,也是肾小球中功能最活跃的细胞,高糖诱导的HGMC衰老是肾脏衰老的重要病理生理学基础。本研究将体内和体外实验相结合,建大鼠和HGMC细胞高糖模型,研究PRO、LOS和MET通过STAT3/p62/p53/p21信号途径对肾脏衰老的作用与机制,为研究肾脏衰老的发生机制提供理论依据,并为开发延缓肾脏衰老的特异性靶点药物提供实验依据。研究方法:1、利用人肾小球系膜细胞（HGMC）进行实验,利用体外高糖干预的方法构建衰老细胞模型。根据实验需要,将细胞分为对照组（Con）和高糖组（HG）。将所有细胞更换为无血清培养液同步化24 h后,对细胞分别给予不同的处理。对照组在正常HGC培养液中培养;高糖组（HG）指在葡萄糖终浓度为30 mmol/L的培养液中分别培养24、48和72 h后收集细胞用于后续实验。采用CCK-8检测高糖暴露对HGMC细胞活力的影响,LDH法检测高糖处理后HGMC细胞LDH释放量,流式细胞术检测细胞凋亡水平,Western Blotting和Real-Time Quantitative PCR分析给予高糖暴露后HGMC细胞内STAT3的蛋白水平和mRNA表达。构建STAT3沉默细胞模型:将STAT3沉默慢病毒转染至HGMC细胞,采用嘌呤霉素筛选7天后获得STAT3沉默的HGMC细胞。染毒分组如下,对照组（Con-NC）、对照组（Con-Si）、30mM高糖组（HG-NC）以及30mM高糖STAT3沉默组（HG-Si）。收集各组细胞选择RNA-seq实验来筛选STAT3潜在的细胞自噬靶基因,采用Real-Time Quantitative PCR分析STAT3潜在靶基因mRNA表达验证RNA测序结果,从而筛选出STAT3下游的关键因子。2、本部分研究将细胞分为对照组（在不含高糖的HGMC培养液中培养）、PRO组（40 μmol/L PRO刺激细胞2 h后,在不含高糖的HGMC培养液中培养）、LOS组（10-5 mol/LLOS刺激细胞2h后,在不含高糖的HGMC培养液中培养）、MET组（50 mmol/L MET刺激细胞2 h后,在不含高糖的HGMC培养液中培养）、高糖组（30 mmol/L葡萄糖刺激细胞72 h）、高糖+PRO组（30 mmol/L葡萄糖加入前2h加入40 μmol/LPRO,培养72 h）、高糖+LOS组（30 mmol/L葡萄糖加入前2h加入10-5 mol/L（10 μmol/L）LOS,培养72h）、高糖+MET组（30 mmol/L葡萄糖加入前2h加入50 mmol/LMET,培养72 h）。检测细胞形态,细胞活力、LDH释放量、STAT3、p62、p53和p21蛋白和mRNA表达的变化、凋亡情况。旨在探讨三种药物对HGMC衰老过程中的STAT3/p62/p53/p21信号途径活性变化及蛋白表达的影响。3、将50只大鼠（实验开始时体重为210±10 g;N=50;雄性和雌性数量相同）按重量随机分为5组,每组10只。五组包括对照组,50 mg/kg链脲佐菌素（STZ）组,普罗布考（PRO）+STZ,氯沙坦（LOS）+STZ和二甲双胍（MET）+STZ组。连续3天腹膜内（st.ip.）注射STZ（50 mg/kg体重的柠檬酸盐缓冲液,pH=4.0）,对照组给予相同剂量的柠檬酸盐缓冲液。该研究仅包括连续两个早晨非空腹血糖水平＞16.7 mmol/l的动物。成功建立STZ模型后,进行药物治疗。对照组和STZ组的大鼠接受腹腔注射,注入0.9%的氯化钠。PRO+STZ组的大鼠接受腹腔注射,注射100 mg/kg PRO。LOS+STZ组的大鼠接受腹腔注射,注射25 mg/kg LOS。MET+STZ组的大鼠接受腹腔注射,注射250 mg/kg MET。在第10周收集尿液。在测量体重和肌肉含量之后,在治疗后10周处死所有大鼠。同时,收集肾脏组织和血液进行进一步分析。每组四只大鼠的肾脏观察组织学变化。从剩余的肾脏中提取总RNA和蛋白质,以测试目标mRNA和蛋白质水平。用收集的血液检测血脂、葡萄糖、尿蛋白、尿素氮、尿白蛋白和肌酐。结果:1、CCK8结果显示,与正常对照组相比,10、20、30、40、50 mmol/L HG组培养24、48、72h后,增殖抑制率明显降低（P＜0.05）。与对照组相比,三个不同时间段HG组的LDH释放量均增加,72 h HG组的LDH释放量较对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。流式结果发现,与对照组相比,高糖模型组细胞的早期凋亡率和总凋亡率均有所升高。Western blotting结果和RT-qPCR结果显示高糖暴露明显升高了HGMC细胞内的STAT3表达。接下来,本研究对HGMC细胞进行了 STAT3沉默处理后采用RNA-seq实验筛选了潜在关键因子,结果显示,p62、p53、p21可能为高糖暴露的HGMC细胞模型中STAT3潜在的下游关键因子。为验证这一推测,我们采用RT-qPCR实验观察上述三个因子mRNA的表达情况,结果发现,HG模型组与对照组相比,p62、p53、p21的mRNA水平均呈增高趋势。STAT3沉默HG模型组与HG模型组相比,p62、p53、p21的mRNA表达水平均呈下降趋势。2、与对照组相比,高糖组、高糖+PRO组、高糖+LOS组和高糖+MET组的细胞活力和LDH释放量均增加且差异具有统计学意义。与高糖组相比,高糖+PRO组、高糖+LOS组和高糖+MET组的细胞活力和LDH释放量有所降低且差异具有统计学意义。与对照组相比,高糖组、高糖+PRO组、高糖+LOS组和高糖+MET组的STAT3、p62、p53和p21蛋白和mRNA表达水平明显增加。而与高糖组相比,高糖+PRO组、高糖+LOS组和高糖+MET组的STAT3、p53、p21蛋白和mRNA表达水平有所降低,高糖+PRO组和高糖+LOS组的p62蛋白和mRNA表达水平有所降低。与对照组相比,高糖组、高糖+PRO组、高糖+LOS组和高糖+MET组细胞的早期凋亡和总凋亡率均有所提升。与高糖组相比,高糖+PRO组、高糖+LOS组和高糖+MET组细胞的早期凋亡和总凋亡率均有所下降。3、与对照组相比,其他组大鼠的体重和肌肉含量均下降。此外,干预组的体重和肌肉含量均增加。而MET组的体重最大,其次是LOS组和PRO组,但明显高于STZ组。STZ组大鼠的肾脏器官指数显着增加。相比之下,干预组每组的肾脏器官指数均显着下降。对于DN大鼠的Upro、ALB、BUN和Cr,与模型组相比,各给药组均有不同程度的恢复,但与对照组相比仍有一定差距。HE染色显示,对照组肾脏结构完整,皮层与髓质边界清晰,肾小球无明显萎缩或肿胀,毛细血管基底无增厚和炎性渗出。模型组和各治疗组肾脏病理变化程度不同,其中模型组肾小管间质损害最严重,肾间质炎性细胞表达增加,可见纤维性结缔组织增生。相反,干预组的病理损害明显减少。同时STZ组的血压,血脂和血糖显著升高。相反,PRO,LOS和MET可以显着降低脂类,血压和血糖水平。STZ诱导的STAT3和p62蛋白和mRNA表达增加。本研究发现PRO、LOS和MET减轻了STZ诱导的肾脏过早衰老。PRO、LOS和MET也抑制STZ诱导的STAT3和p62激活。结论:1.高糖上调肾脏信号转导和转录激活因子STAT3引起HGMC细胞衰老。2.高糖经STAT3调控p62/p53/p21细胞自噬信号途径的表达从而导致细胞衰老。3.PRO、LOS和MET的治疗可拮抗STAT3/p62/p53/p21信号途径的破坏,进而延缓大鼠肾脏衰老。