【摘 要】
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目的:本文旨在探究前列腺癌细胞外泌体诱导巨噬细胞M2型分化,进而探明巨噬细胞中lnc RNA MIR22HG参与M2型分化的分子机制,明确lnc RNA MIR22HG对巨噬细胞功能的影响。方法:1、Millipore超滤法分离PC-3外泌体（PC-3 exos）和RWPE-1外泌体（RWPE-1 exos）,透射电子显微镜、纳米粒径分析和流式细胞仪进行外泌体鉴定;2、PC-3 exos诱导巨噬细
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目的:本文旨在探究前列腺癌细胞外泌体诱导巨噬细胞M2型分化,进而探明巨噬细胞中lnc RNA MIR22HG参与M2型分化的分子机制,明确lnc RNA MIR22HG对巨噬细胞功能的影响。方法:1、Millipore超滤法分离PC-3外泌体（PC-3 exos）和RWPE-1外泌体（RWPE-1 exos）,透射电子显微镜、纳米粒径分析和流式细胞仪进行外泌体鉴定;2、PC-3 exos诱导巨噬细胞:THP-1细胞用PMA（10 ng/m L）诱导为巨噬细胞,再用RPMI 1640培养48 h,为M0组。加入IL-4（25 ng/m L）刺激M0 48h后为M2组,分别将所提取外泌体（100 ug/m L）加入到巨噬细胞中,48 h后为PC-3-exo-Mφ组与RWPE-1-exo-Mφ组,GW4869处理PC-3收集条件培养基,浓缩洗涤条件培养基处理M0 48 h后为GW4869-Mφ组;3、免疫荧光检测各组巨噬细胞CD206的表达,ELISA法检测各组细胞上清中细胞因子的表达;4、用q PCR检测M0,M2,PC-3-exo-Mφ各组细胞中lnc RNA MIR22HG表达量;5、ASO-lnc RNA MIR22HG（反义寡核苷酸）转染巨噬细胞,敲低巨噬细胞中lnc RNA MIR22HG,荧光显微镜观察巨噬细胞吞噬CY3标记酵母多糖的能力,体外血管形成实验观察lnc RNA MIR22HG对巨噬细胞促血管形成能力的影响;6、RNA荧光原位杂交定位PC-3-exo-Mφ中lnc RNA MIR22HG的分布;7、RNA免疫共沉淀（RIP）检测PC-3-exo-Mφ细胞核中lnc RNA MIR22HG与c-MYC结合情况;8、细胞染色质免疫共沉淀（Ch IP）检测PC-3-exo-Mφ中c-MYC和CD206、TGF-β和SIRP-α启动子结合情况;9、ASO敲低巨噬细胞中lnc RNA MIR22HG,免疫组化检测裸鼠肿瘤组织中巨噬细胞CD206表达量。结果:1、电镜和纳米粒径分析结果显示通过Millipore超滤方法富集、分离的外泌体形态多为圆形,直径约在40～160 nm;经CD63磁珠分选外泌体后,流式检测到其表面表达外泌体特异性分子标志CD9;2、通过细胞因子或外泌体分别诱导巨噬细胞,实验分为五组:M0组,M2组,PC-3-exo-Mφ组,RWPE-1-exo-Mφ组和GW4869-Mφ组;3、经PC-3 exos诱导后的PC-3-exo-Mφ组中CD206绿色荧光阳性率较高,和M2型巨噬细胞差异不大,阳性细胞数占总细胞数的70%。M2和PC-3-exo-Mφ组细胞上清中IL-10、TGF-β因子的表达上升,IL-6和TNF-α表达下降;4、M2和PC-3-exo-Mφ中lnc RNA MIR22HG表达水平较M0高,但PC-3-exo-Mφ和M2之间无差异;5、巨噬细胞转染ASO-lnc RNA MIR22HG后,lnc RNA MIR22HG显著下调,PC-3-exo-Mφ的吞噬能力和M0相比显著下降,敲低lnc RNA MIR22HG后巨噬细胞吞噬能力和PC-3-exo-Mφ相比显著升高,并且敲低组促体外血管形成能力下降;6、PC-3-exo-Mφ中lnc RNA MIR22HG分布于细胞质和细胞核中;7、RIP实验结果显示在PC-3-exo-Mφ细胞核中lnc RNA MIR22HG和c-MYC结合;8、Ch IP结果显示c-MYC与CD206、TGF-β和SIRP-α启动子结合;9、敲低lnc RNA MIR22HG后,裸鼠巨噬细胞CD206表达量相比于空白组和NC组显著下降。结论:PC-3 exos诱导巨噬细胞中lnc RNA MIR22HG的表达显著增高,促进CD206、TGF-β和SIRP-α的表达,从而导致巨噬细胞M2分化,吞噬功能显著下降,这可能是因为PC-3 exos通过上调巨噬细胞中lnc RNA MIR22HG,从而促进c-MYC下游靶基因表达,参与巨噬细胞M2分化。
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