第一部分XIAP RING结构域通过介导miRNA-4295表达进而抑制p63α的表达和促进膀胱上皮细胞恶性转化　　一、背景和目的:　　X连锁的细胞凋亡蛋白抑制因子(XIAP)是IAP家族的一员，是一种潜在的细胞凋亡抑制因子。据报道XIAP在急性、慢性白血病，前列腺癌和很多其他癌症中均程高表达，提示XIAP的过表达和可能与癌症的发展相关。最近，我们的研究表明XIAP存在一些与细胞凋亡无关的功能，包括周期蛋白D1的上调后促进膀胱癌细胞的生长和抑制RhoGDIα的赖氨酸138位点的SUMO化来促进F肌动蛋白的形成和结肠癌细胞的侵袭等。另有其他的研究报道XIAP过表达和癌症患者的癌症发展，药物抵抗和不良预后相关。　　XIAP其氨基末端有三个重复的BIR结构域，和羧基末端的RING结构域。BIR结构域可抑制半胱天冬酶3、7和9，主要负责XIAP抑制细胞凋亡的功能，羧基末端的RING结构域，表现出E3泛素连接酶的活性，使IAP通过蛋白酶体引起自身泛素化，半胱天冬酶3，7泛素化。近来，我们发现XIAP的BIR结构域能够直接结合转录因子E2F1并增加它的反式激活能力。相反，XIAP RING结构域的生物学功能和分子机制尚不完全清楚。我们之前的报道阐明了RING结构域具有抑制RhoGDIα的赖氨酸138位点的泛素化和抑制F肌动蛋白形成和人结肠癌细胞侵袭等部分功能。　　在肿瘤抑制基因P53发现的20年间，我们又发现了p63和p73基因。p63蛋白是转录因子p53蛋白家族的成员之一，对上皮组织的发展非常重要。现已经表明p63基因缺陷的小鼠存在一些发育缺陷，缺少四肢、牙齿和乳腺等。p63基因通过不同的启动子编码两种主要的异构体，TAp63和△Np63，具有不同的转录能力。TAp63包含一个转录激活结构域(TAD)，可启动p53相关调控基因的转录，例如p21、bax、mdm2和其他特异的靶基因，然而△Np63缺乏转录激活结构域(TAD)。尽管肿瘤的形成机制尚未完全清楚，但仍有报道称p63的缺失可导致自发性肿瘤的形成。p63α是p63最长的TA转录组变体，作为肿瘤抑制因子阻止癌症的发展。然而，大部分已有的研究主要集中于p63α调控的下游效应因子，对于p63α的上游调控机制了解很少。这激发我们开展目前的研究工作。　　本课题的研究让我们更加深入的了解XIAP及其RING结构域和p63α在膀胱上皮细胞恶性转化中的作用，并为膀胱癌预防和治疗提供一些潜在的新靶点。　　二、方法:　　1.体内外实验共同研究XIAP RING结构域对p63α的调控:　　首先体外实验，在正常膀胱上皮细胞系UROtsa中转染特异性敲减XIAP的shRNA，建立稳定转染细胞株后检测p63α的表达情况，另外，在UROtsa中分别过表达XIAP(△BIR)和XIAP(△RING)结构域，建立稳转细胞系后检测p63α的表达情况。其次在体内实验，利用RING缺失的XIAP敲入小鼠，提取小鼠的膀胱上皮细胞，通过WB检测p63α的表达情况。　　2.细胞非贴壁依赖性实验检测XIAP RING结构域和p63α对膀胱上皮细胞恶性转化的影响:　　利用EGF可以诱导UROtsa细胞恶性转的细胞模型，对XIAP RING结构域和p63α在诱导膀胱上皮细胞恶性转化过程中的作用，用已经建立好的UROtsa敲减XIAP和相应对照的稳转细胞做细胞非贴壁依赖性实验，用EGF诱导其恶性转化，明确XIAP对细胞恶性转化的作用。利用UROtsa中分别过表达XIAP(△BIR)和XIAP(△RING)结构域和相应对照组做细胞非贴壁依赖性实验，确定是由XIAP的哪个结构域参与了对膀胱上皮细胞恶性转化的调控。因为UROtsa中过表达XIAP(△BIR)后p63α升高，在此过表达XIAP(△BIR)中转染特异性敲减p63α的shRNA和它的对照组Nonsense，并建立稳转细胞系，比较这两株细胞系对EGF诱导上皮细胞恶性转化的影响。　　3.XIAP RING结构域影响p63α表达的分子机制研究:　　利用反转录PCR检测UROtsα中敲减XIAP和UROtsa中过表达XIAP(△BIR)与其相应对照组细胞间p63αmRNA的表达情况。利用蛋白翻译抑制剂CHX处理UROtsα中敲减XIAP和UROtsa中过表达XIA P(△BIR)与其相应对照组细胞，抑制p63α的翻译后，比较p63α的降解速率。利用35S标记蛋氨酸，半胱氨酸标记新合成的蛋白，通过用特异性抗p63α的抗体沉淀p63α，并通过放射自显影检测比较UROtsa中敲减XIAP和对照细胞组间新和成的p63α的速率。利用萤光素酶报告载体，将p63α的3UTR区域通过PCR构建至pmir-report载体中，将带有p63α3UTR的萤光素酶报告载体和TK一起转入UROtsa敲减XIAP和相应对照细胞，UROtsa中过表达XIAP(△BIR)结构域和相应对照细胞，以TK为内参，比较p63α3UTR活性的改变。　　4.分析XIAP RING结构域调控的可以影响p63α翻译的miRNA:　　利用在线分析网站targetscan分析可以结合到p63α3UTR的miRNA，合成相应的miRNA的引物，通过实时荧光定量PCR，比较这些miRNA在UROtsa敲减XIAP和相应对照细胞，UROtsa中过表达XIAP(△BIR)结构域和相应对照细胞中的差别，从而筛选出可能可以结合到p63α3UTR并调控p63α翻译的miRNA。通过在UROtsa中过表达该miRNA，用实时荧光定量PCR检测过表达效率，用WB检测该miRNA过表达后对p63α的影响，而从明确该miRNA参与XIAP RING结构域对p63α翻译的调节。　　5.验证调节p63α翻译的miR-4295对膀胱上皮细胞恶性转化的影响:　　用细胞非贴壁依赖性实验检测UROtsa中过表达该miRNA后对EGF诱导的上皮细胞恶性转化的影响，而从明确miR-4295参与XIAP RING结构域对p63α翻译的调节和上皮细胞恶性转化的影响。　　6.XIAP RING结构域对调节p63α翻译的miR-4295调控分子机制研究:　　利用NCBI分析miR-4295在基因组上的具体位置，主要分析miR-4295是独立表达还是和某个宿主基因一起表达。利用反转录PCR比较miR-4295宿主基因VTI1A在UROtsa敲减XIAP和相应对照细胞，UROtsa中过表达XIAP(△BIR)结构域和相应对照细胞中的差别，从而明确XIAP RING结构域调控miR-4295的可能途径。　　三、结果:　　1.在体内外的膀胱上皮细胞中，XIAP可通过其RING结构域特异的抑制p63α蛋白表达。　　WB结果表明XIAP能抑制p63α蛋白的表达。异源表达HA-△BIR可抑制UROtsa细胞中p63α蛋白的表达，而过表达HA-△RING并没有显示这些生物学功能。在XIAP△RING结构域基因敲入小鼠中证实了XIAP RING结构域对p63α表达的抑制效应，表明p63α蛋白的表达在XIAP△RING基因敲入小鼠的膀胱上皮细胞中比XIAP-WT小鼠更高，在XIAP△RING基因敲入的小鼠中发现p63α表达上调。我们的结果表明了，XIAP的RING结构域对体内外膀胱上皮细胞中p63α蛋白的表达都起了抑制效应。　　2.p63α的下调对XIAP RING结构域介导的人膀胱上皮细胞的恶性转化至关重要。　　细胞非贴壁依赖性实验证明了，XIAP促进人膀胱上皮细胞的恶性转化主要是通过其RING结构域，在UROtsa稳定过表达HA-△BIR结构域的细胞中再转入p63α过表达的质粒，比较其细胞非贴壁依赖性生长能力，发现p63α回转后可明显抑制UROtsa稳定过表达HA-△BIR结构域的细胞的受EGF诱导的细胞非贴壁依赖性生长的能力，表明了p63α的下调对XIAP RING结构域介导的人膀胱上皮细胞的恶性转化至关重要。　　3.XIAP RING结构域抑制人膀胱UROtsa细胞中p63α蛋白的翻译。　　反转录PCR比较UROtsa(shXIAP)和UROtsa(HA-△BIR)与对照组细胞UROtsa(Nonsense)和UROtsa(Vector)中p63α的mRNA水平，显示并无显著差别，蛋白合成抑制剂CHX作用下，在UROtsa(shXIAP)和UROtsa(Nonsense)中检测p63α蛋白的降解速率。结果显示，p63α蛋白在UROtsa(shXIAP)细胞中的降解速率比UROtsa(Nonsense)中的要快。短期的蛋白合成脉冲标记实验比较UROtsa(shXIAP)和UROtsa(Nonsense)细胞中p63α的蛋白翻译速率，35S标记的甲硫氨酸和半胱氨酸用来新合成p63α蛋白，相同时间内UROtsa(shXIAP)细胞合成的新蛋白比UROtsa(Nonsense)明显增加。说明XIAP RING结构域抑制人膀胱UROtsa细胞中p63α蛋白的表达在翻译水平。　　4.miR-4295通过靶向结合p63α mRNA3UTR来介导RING结构域抑制p63α的蛋白翻译。　　用p63α3UTR荧光素酶报告载体比较p63α3UTR UROtsa(Nonsense)和UROtsa(shXIAP)细胞，UROtsa(Vector)和UROtsa(HA-△BIR)细胞中的活性，XIAP敲减后显著提高了p63α3UTR的活性，而异源表达HA-△BIR显著抑制了p63α3UTR的活性，揭示了XIAP RING结构域通过作用于p63α mRNA的3UTR抑制p63α蛋白的翻译。在线Targetscan6.2软件来分析miR-4295能结合p63α mRNA3UTR，实时荧光定量PCR结果显示miR-4295的表达在UROtsa(shXIAP)细胞中是受抑制的，而在UROtsa(HA-△BIR)中是显著上升的，miR-4295的表达和预期调控p63αmRNA的3UTR活性是一致的，结果提示了miR-4295通过靶向结合p63α mRNA3UTR来介导RING结构域抑制p63α的蛋白翻译。　　5.miR-4295介导RING结构域促进UROtsa细胞的恶性转化。　　我们构建了过表达miR-4295的质粒并和p63α3UTR荧光素酶报告载体一起稳定转入UROtsa细胞，UROtsa细胞过表达miR-4295后p63α3UTR活性明显被抑制，同时WB检测p63α的蛋白表达量也明显下降，细胞非贴壁依赖性实验发现UROtsa细胞中过表达miR-4295以后可明显增加EGF诱导细胞恶性转化能力。结果提示了miR-4295介导XIAP RING结构域促进UROtsa细胞的恶性转化。　　6.XIAP的RING结构域通过上调Sp1蛋白的表达和转录活性进而促进miR-4295转录。　　NCBI数据库比对找到了miR-4295的宿主基因，结果显示miR-4295的前体由VTI1A基因的内含子区域编码。反转录PCR和WB检测敲低XIAP基因后VTI1A的表达名明显受抑制，然而过表达HA-△BIR提高了VTI1A的蛋白和mRNA水平的表达。VTI1A启动子荧光素酶报告载体比较两对细胞UROtsa(Nonsense)细胞和UROtsa(shXIAP)细胞，UROtsa(vector)细胞和UROtsa(HA-△BIR)细胞中VTI1A启动子，结果显示，VTI1A启动子荧光报告基团的转录活性在UROtsa(shXIAP)细胞中显著下调，在UROtsa(HA-△BIR)细胞中上调，表明XIAP RING结构域对VTI1A和miR-4295的调控在转录水平。比较可结合至VTI1A启动子区域的转录因子的表达情况，发现Sp1的表达水平及活性与VTI1A启动子活性一致，提示XIAP的RING结构域通过上调Sp1蛋白的表达和转录活性来促进miR-4295转录。　　四、结论:　　在目前的研究中，我们首次发现敲减XIAP的表达后可诱导p63α蛋白的上调，然而在正常膀胱上皮细胞中过表达XIA(△BIR)后可下调p63α的表达。这与RING缺失的XIAP敲入小鼠的膀胱组织中的表现一致，证明了XIAP RING结构域在体内外膀胱上皮细胞对p63α表达的新型抑制效应。我们接下来的功能研究也揭示了，XIAP RING结构域对p63α蛋白表达的抑制，对表皮生长因子诱导人正常膀胱上皮细胞的恶性转化非常重要。进一步的机制研究揭示了XIAP RING结构域能够启动miR-4295的转录，而miR-4295可以靶向作用于p63αmRNA的3，UTR，从而抑制p63α蛋白的翻译。而且，XIAP RING在人膀胱上皮细胞中上调Sp1蛋白对miR-4295的转录表达非常重要，Sp1作为转录因子可以激活miR-4295的宿主基因VTI1A的转录，从而增加miR-4295的表达量。总的来说，我们的研究揭示了XIAP RING结构域在体内外的一个新功能，即通过上调Sp1表达来增加miR-4295的转录，从而降低p63α蛋白的翻译，最终导致及膀胱上皮细胞恶性转化。　　第二部分膀胱癌非转移性细胞系T24和其转移性衍生态T24T在细胞侵袭和迁移能力的不同表现及具体机制研究　　一、背景和目的:　　癌细胞迁移和浸润能力的获得是发生转移的关键。先前的研究认为迁移和浸润时具有相同的生物学意义，但我们最近的研究结果显示它们是两个不同的事件。细胞迁移包含大量步骤:细胞与细胞间黏附的消失、细胞膜向运动方向突出，前端和尾端与细胞外基质黏着解离，肌动蛋白细胞骨架收缩驱动胞体向前。癌细胞的转移同样包含很多步骤:渗入连接组织、进入血液和免疫系统、在远隔器官形成一个新的肿瘤。　　超氧化物歧化酶(SOD)是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶。线粒体电子传递链产生有毒的超氧化物，SOD2可将其转化为过氧化氢和二价氧，并参与活性氧的反应过程。最近的研究显示，SOD2在高级别和晚期膀胱癌中持续增加并在癌症的发展和转移发挥着重要作用。Rho-GTPases包括CDC42和Rac1，它们在调控细胞迁移过程中发挥着重要作用，参与黏附、附着解离、去黏附、极化和细胞骨架机化。由于CDC42和Rac1在细胞迁移中的重要性，细胞中这些GTPases自然平衡的打乱最终将导致表现出转移表型。SOD2、CDC42/Rac1和JNK/c-Jun已被大家熟知参与癌症的发展和迁移。然而，SOD2、CDC42/Rac1和JNK/c-Jun在膀胱癌浸润和迁移中的作用仍然未知。　　细胞外基质的水解对癌细胞的浸润和转移十分重要，肿瘤细胞通过分泌蛋白如MMP-2和MMP-9来促进水合作用。MMP-2也被称为72KDa的Ⅳ型胶原酶，降解基底膜的一个主要结构成分Ⅳ型胶原。MMP-2被报道参与多数癌症的转移，包括结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌等，但与膀胱癌的关系尚不明确。　　为了探究参与膀胱癌细胞迁移和浸润的这些分子的生物学意义，我们对比研究了一对具有不同转移特征的同源的膀胱癌细胞系T24和T24T的迁移和浸润能力和它们潜在的机制。虽然T24细胞具有有限的转移能力，但其衍生细胞系T24T细胞具有较强的转移能力。检测上述分子在T24和T24T细胞中蛋白和mRNA的表达水平，并探究这些蛋白质间的潜在关系。本课题为研究膀胱癌细胞迁移和浸润的分子基础提供了新的观点，揭示了针对膀胱癌细胞转移的新的治疗靶点。　　二、方法:　　1.比较高度转移的人膀胱癌T24T细胞和其同源T24细胞中迁移与浸润能力。　　利用划痕修复实验，比较人膀胱癌T24T细胞和其同源T24细胞间的迁移能力，通过细胞浸润实验，比较人膀胱癌T24T细胞和其同源T24细胞间的细胞浸润能力　　2.T24T比T24具有较低迁移能力的分子机制研究。　　WB分析可能的可以参与调节细胞迁移的小GTP酶CDC42、Rac1、RhoA和SOD2的表达水平。利用realtime-PCR检测CDC42和Rac1的mRNA水平。将特异性靶向SOD2的小发夹RNA(shSOD2)转染到T24T细胞中，比较T24T(nonsense)和T24T(shSOD2)细胞间的小GTP酶表达水平和细胞迁移能力。　　3.SOD2抑制T24T细胞迁移能力的分子机制研究。　　比较T24和T24T，T24T(nonsense)和T24T(shSOD2)细胞间的MAPK通路中的JNK，Erk，p38的表达情况，筛选出受SOD2调控的某一条通路。并在T24T(shSOD2)细胞中抑制c-Jun后比较对小GTP酶表达水平和细胞迁移能力的影响。　　4.SOD2受调控表达的分子机制研究。　　RT-PCR检测T24和T24T细胞间SOD2的mRNA水平，从而确定SOD2受调控是否在mRNA水平。我们把SOD2启动子驱动的荧光素酶报告载体转染到T24细胞和T24T细胞中，检测和比较两种细胞系中SOD2的启动子活性和转录表达能力。用启动子区域结合转录因子分析网站分析了能结合SOD2启动子区域的潜在转录因子。通过敲减相应转录因子的表达验证对SOD2启动子活性，SOD2mRNA水平，SOD2蛋白水平和细胞迁移能力的影响，从而筛选出调控SOD2表达的转录因子。　　5.T24T比T24具有较高浸润能力的分子机制研究。　　首先比较T24T敲减SOD2后对细胞浸润能力的影响，WB和RT-PCR结合分析可能的可以参与调节细胞浸润能力的蛋白:MMP-2，MMP-9和VEGE将MMP-2特异性的shRNA转染到T24T细胞，构建T24T shMMP-2稳定细胞，比较敲减MMP-2以后对细胞浸润能力的影响。　　6.MMP-2受调控表达的分子机制研究。　　RT-PCR检测T24和T24T细胞间MMP-2的mRNA水平，从而确定MMP-2受调控是否在mRNA水平。将MMP-2启动子驱动的荧光素酶报告载体转染到T24和T24T细胞中，构建稳定转染子并用于比较MMP-2在这两种细胞内的转录活性，从而确定MMP-2受调控是否在转录水平。用放线菌素D(Act D)处理T24和T24T，抑制其MMP-2的mRNA合成，然后比较MMP-2的mRNA在T24和T24T间的降解速率，WB分析比较可以调节mRNA稳定性的蛋白在T24和T24T间的表达情况，通过特异性敲减Nucleolin，检测其对MMP-2的表达水平的影响和对细胞浸润能力的影响，从而确定其参与调节MMP-2的表达和细胞的浸润能力。　　三、结果:　　1.高度转移的人膀胱癌T24T细胞较其同源T24细胞具有低迁移能力和高浸润能力。　　为了探究T24与T24T细胞的细胞迁移，我们利用划痕实验检测，划痕36小时后，T24细胞系已经完全愈合，而T24T细胞只有部分愈合，表明T24T细胞与T24细胞相比具有较低的迁移能力。细胞浸润实验的结果显示，与T24细胞相比，T24T提高了其浸润能力，表明高细胞迁移活性并不一定意味着高浸润活性。　　2.SOD2参与抑制T24T细胞迁移。　　观察T24和T24T细胞，检测细胞中小GTP酶CDC42、Rac1和RhoA的表达水平。与T24细胞相比，T24T细胞中CDC42、Rac1和RhoA蛋白表达明显下降，这些结果提示了CDC42/Rac1可能参与T24T细胞的细胞迁移抑制。我们检测了T24和T24T细胞中SOD2的表达情况。结果显示，SOD2的表达在T24T细胞中显著升高，将特异性靶向SOD2的小发夹RNA(shSOD2)转染到T24T细胞中，与T24T(nonsense)细胞相比，T24T细胞敲减SOD2后，CDC42和Rac1的蛋白和mRNA表达水平升高，同样增加了细胞迁移活性。　　3.SOD2通过靶向JNK/AP-1/GTPase通路抑制T24T细胞迁移。　　对比于T24细胞，T24T细胞中JNK和Erk的磷酸化水平明显降低而p38仅有轻微降低;然而T24与T24T细胞的JNK、p38和Erk蛋白表达水平相近，T24TshSOD2细胞表现出较高的JNK、Erk和c-JUN活性，而T24T shSOD2细胞中与其空载体对照转染细胞T24T nonsense细胞相比，p38的总体水平和磷酸化水平相近，这些结果显示SOD2可抑制JNK、Erk和其下游转录因子c-JUN/AP-1的功能，p38可能未参与SOD2对细胞迁移的调节。将显性负突变c-Jun突变体TAM67转染到T24T shSOD2细胞中。结果显示CDC42/Rac1表达水平和细胞迁移能力显著下降。利用抑制剂SP600125(特异性针对JNK)和PD98059（特异性针对MEK/Erk）处理T24细胞，检测表明SOD2是JNKs调节c-Jun活化的上游作用因子，而JNKs通过c-Jun来参与SOD2对细胞迁移的调节，然而Erk不参与c-Jun介导的T24细胞的细胞迁移。　　4.转录因子Sp1过表达介导T24T细胞SOD2的转录和蛋白的表达。　　RT-PCR结果显示SOD2的mRNA水平在T24T细胞中比T24细胞中高，SOD2启动子驱动的荧光素酶报告载体报告在T24T细胞中SOD2启动子的活性比T24细胞高4倍，揭示了SOD2在T24T细胞中表达增加是发生在转录水平。分析了能结合SOD2启动子区域的潜在转录因子，包括AP-1，STAT和多位点的Sp1转录因子。相比较T24细胞，Sp1的表达和Sp-1依赖性的转录活性在T24T细胞中都是显著增加的，发现在T24T敲减Sp1后，细胞中SOD2蛋白水平和mRNA水平的表达都是明显降低的，相应的，SOD2启动子驱动的荧光素酶活性在T24T shSp1细胞中被抑制，同时T24T细胞的细胞迁移能力显著增加。　　5.MMP-2表达增加能促进T24T细胞的浸润。　　MMP-2在T24T细胞中蛋白水平和mRNA水平都是增加的，而MMP-9在mRNA水平却是减少的，VEGF并无显著差异。将MMP-2特异性的shRNA稳定转染到T24T细胞后，与其对照组nonsense转染细胞相比，MMP-2的敲低减少了T24T细胞的浸润能力。　　6.核仁素增加了MMP-2的mRNA稳定性。　　MMP-2的启动子转录活性在T24T细胞和T24细胞间是相当的，放线菌素D(Act D)处理后T24和T24T细胞，RT-PCR结果显示，MMP-2在T24T细胞中mRNA的半衰期比T24细胞中更长，揭示了T24T细胞内由于MMP-2 mRNA稳定性增加MMP-2呈高水平表达。可以影响mRNA稳定性的蛋白AUF1和HuR在T24和T24T细胞中的蛋白表达水平都是相近的，但是核仁蛋白在T24T细胞中是升高的，在用RNA免疫共沉淀RNA-IP分析，结果显示核仁蛋白能特异性的结合到MMP-2 mRNA上，特异性敲减核仁蛋白的表达后，导致了MMP-2表达减少，同时也抑制了细胞的浸润能力。　　四、结论:　　先前关于癌细胞浸润的研究主要集中在它的迁移能力，因为这两个事件常被认为具有相同生物学意义，认为肿瘤细胞具有高迁移能力则等同于具有高浸润能力。而我们的研究发现T24T细胞比T24细胞具有更高的浸润能力和较低的迁移能力。T24T细胞与T24细胞相比，Rho-GDPases表达较低而SOD2表达较高。事实上，我们在T24T细胞中敲减SOD2后可明显降低细胞迁移，而对细胞浸润能力却没有影响。重要的是，基质金属蛋白酶2(MMP-2)在T24T中是高表达的，并参与细胞浸润，而MMP-2过表达由大量的核仁素核转运介导，核仁素可直接结合并增加MMP-2的mRNA稳定性。总之，我们的研究揭示了人膀胱癌T24T细胞中细胞迁移和浸润间的相反关系，表明了一个新的机制，即SOD2和MMP-2对调节人膀胱癌T24T细胞迁移与浸润中的转移行为有着不同作用。