[目的]鉴于Ras基因突变和Ras蛋白过表达与肿瘤的发生、发展、肿瘤的浸润和转移以及预后密切相关,故从1982年第一株抗p21Ras单克隆抗体杂交瘤细胞株(Y13-159)建立以来,国外研究人员已开发出多株抗p21Ras单克隆抗体杂交瘤细胞株(Y13-258、YA6-172、Y13-128、NCC001/004、Ras10/11、RAP-1/5),以及在此基础上利用基因工程技术建立的抗p21Ras小分子抗体(ScFv),体外实验显示出良好的抗肿瘤活性。然而,国内对Ras基因,p21Ras蛋白的结构、功能研究的报道较少,对p21Ras抗体的研究尚未见报道。当今,随着基因工程技术的迅猛发展,针对p21Ras蛋白信号通路的靶向治疗已成为了肿瘤治疗的研究热点。本实验室在国家自然科学基金和云南省科技攻关项目的资助下,建立稳定分泌抗p21Ras单克隆抗体的杂交瘤细胞株,计划在此基础上进一步构建抗p21Ras的细胞内抗体,用于与Ras有关的肿瘤细胞体外研究和体内肿瘤靶向治疗。前期实验显示,该单克隆抗体可特异性识别p21Ras-H、N、K三种蛋白,是一种广谱抗p21Ras的单抗。本实验拟应用自主研制的广谱抗p21Ras单克隆抗体KGH-R1,通过免疫组化技术观察大肠良恶性组织中p21Ras的表达,检测该抗体的敏感性和特异性,并研究该抗体的实体肿瘤相应的表达谱,为将来本实验室研制的细胞内抗体用于临床肿瘤的靶向治疗提供理论和实践依据;同时通过检测p21Ras在大肠癌及其前驱病变中的表达,探讨Ras与大肠癌发生发展与转移之间的关系。[方法]1、广谱抗p21Ras单克隆抗体KGH-R1的制备(已由本实验室的其他人员制备完成):基于p21Ras-H、p21Ras-K、p21Ras-N三种Ras蛋白N端氨基酸序列具有85%的同源性,1-80位氨基酸残基高度保守的理论,本实验室利用杂交瘤技术,用纯化和复性后的p21Ras-H蛋白反复4次免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、HAT选择性培养、间接ELISA法筛选及4次克隆化获得了分泌广谱抗p21Ras-H、p21Ras-K、p21Ras-N单克隆抗体的杂交瘤细胞株KGH-R1。2.标本采集:收集成都军区昆明总医院45例正常大肠粘膜组织(距离大肠癌边缘组织5cm以上的正常粘膜组织),73例大肠炎症性息肉组织,48例大肠低级别上皮内瘤变,83例大肠高级别上皮内瘤变,94例大肠浸润性腺癌组织。3.免疫组化染色与结果判定:应用免疫组织化学SP法检测p21Ras的表达情况,用免疫组化半定量法(阳性细胞百分数及Hscore评分系统)判定结果,应用SSPS统计软件分析p21Ras在大肠良恶性病变中的表达情况:(1)比较正常大肠上皮组织、大肠普通炎性息肉,大肠低级别上皮内瘤变,大肠高级别上皮内瘤变及浸润性大肠腺癌中p21Ras的表达;(2)比较大肠腺癌病变组织及其癌旁组织(包括正常大肠上皮组织,大肠低级别上皮内瘤变,大肠高级别上皮内瘤变)中p21Ras的表达;研究大肠癌p21Ras的表达与临床病理指标(性别、年龄、组织学分级、组织学类型、肿瘤部位、肿瘤大小、肿瘤浸润深度和淋巴结转移)的关系。[结果]1、本实验室自主制备的广谱抗p21Ras单克隆抗体(KGH-R1)与大肠上皮细胞内的p21Ras蛋白发生免疫反应的产物定位于细胞浆及细胞膜。p21Ras在正常大肠黏膜上皮组织几乎不表达,p21Ras在正常大肠黏膜上皮组织,大肠的普通炎性息肉,大肠低级别上皮内瘤变,大肠高级别上皮内瘤变及浸润性大肠腺癌的表达用Hscore系统评分(0-300分),结果均值分别为1.23±2.98、7.14±16.74、66.54±59.91、94.20±87.46、116.14±103.30依次增高,以及用阳性细胞百分数(0-100%)评分,结果均值分别为1.23±2.98、7.06±15.64、53.33±42.36、57.28±48.73、63.11±47.11依次增高。五组病变的阳性细胞百分数比较有显著的统计学差异(P＜0.01);五组病变的Hscore评分比较有显著的统计学差异(P＜0.01)。阳性细胞百分数两两比较结果为:正常大肠粘膜与大肠炎性息肉无统计学差异(P＞0.05);大肠炎性息肉与大肠低级别上皮内瘤变有显著统计学差异(P＜0.01);大肠低级别上皮内瘤变与大肠高级别上皮内瘤变无统计学差异(P＞0.05);大肠高级别上皮内瘤变与大肠浸润性癌无统计学差异(P＞0.05)。Hscore评分两两比较结果为:正常大肠粘膜与大肠炎性息肉无统计学差异(P＞0.05);大肠炎性息肉与大肠低级别上皮内瘤变有显著统计学差异(P＜0.01);大肠低级别上皮内瘤变与大肠高级别上皮内瘤变无统计学差异(P＞0.05);大肠高级别上皮内瘤变与大肠浸润性癌无统计学差异(P＞0.05)。2、p21Ras在Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级分化的大肠腺癌组织中表达的Hscore评分,各分级间具有显著统计学差异(P＜0.01);阳性细胞百分数数值,各分级间具有显著统计学差异(P＜0.01)。p21Ras在大肠腺癌和大肠粘液腺癌的表达Hscore评分,组间比较有统计学差异(P＜0.05);阳性细胞百分数组间比较有统计学差异(P＜0.05)。有淋巴结转移组和无淋巴结转移组的大肠癌组织p21Ras的表达Hscore评分,组间比较有统计学差异(P＜0.05);阳性细胞百分数组间比较有统计学差异(P＜0.05)。p21Ras在男、女组的大肠癌组织表达Hscore评分,组间比较无统计学差异(P＞0.05);阳性细胞百分数组间比较无统计学差异(P＞0.05)。p21Ras在≤50岁和＞50岁组的大肠癌组织表达,Hscore评分组间比较无统计学差异(P＞0.05);阳性细胞百分数组间比较无统计学差异(P＞0.05)。p21Ras在肿瘤直径＜2cm、2-5cm和＞5cm组的大肠癌组织表达,Hscore评分组间比较无统计学差异(P＞0.05);阳性细胞百分数组间比较无统计学差异(P＞0.05)。p21Ras在肿瘤浸润深度为浅肌层、深肌层和全层三组的大肠癌组织表达Hscore评分组间比较无统计学差异(P＞0.05);阳性细胞百分数组间比较无统计学差异(P＞0.05)。3、p21Ras在大肠癌旁组织(包括正常粘膜上皮组织、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变组织和浸润性大肠癌)的表达,Hscore评分均值依次增高,四组比较有显著的统计学差异(P＜0.01),两两比较结果为:正常大肠粘膜与大肠低级别上皮内瘤变有显著统计学差异(P＜0.01),大肠低级别上皮内瘤变与高级别上皮内瘤变无统计学差异(P＞0.05),大肠高级别上皮内瘤变与大肠浸润性癌有统计学差异(P＜0.05)。阳性细胞百分数均值依次增高,四组比较有显著的统计学差异(P＜0.01),两两比较结果为:正常大肠粘膜与大肠低级别上皮内瘤变有显著统计学差异(P＜0.01),大肠低级别上皮内瘤变与高级别上皮内瘤变无统计学差异(P＞0.05),大肠高级别上皮内瘤变与大肠浸润性癌有统计学差异(P＜0.05)。4、大肠普通腺癌与黏液腺癌的临床病理特征比较结果为:黏液腺癌的男性发病率高于女性发病率,与普通腺癌相比有统计学差异(P＜0.05);黏液腺癌的发病年龄平均低于普通腺癌,但没有统计学意义(P＞0.05);黏液腺癌的发病部位在左半大肠为主,但与普通腺癌相比没有统计学差异(P＞0.05);黏液腺癌的淋巴结转移明显高于普通腺癌,有显著的统计学差异(P＜0.01)。5、p21Ras在大肠腺瘤的表达:Hscore评分均值比较,男性组与女性组,组间比较无统计学意义(P＞0.05);≤50岁组与＞50岁组,组间比较无统计学意义(P＞0.05);左半大肠组与右半大肠组,组间比较无统计学意义(P＞0.05);管状组,管状-绒毛状组和绒毛状组,组间比较无统计学意义(P＞0.05);肿瘤直径＜1cm组,1-2cm组和＞2cm组,组间比较无统计学意义(P＞0.05);低级别上皮内瘤变组和高级别上皮内瘤变组,组间比较无统计学意义(P＞0.05)。阳性细胞百分率数值均值比较,男性组和女性组,组间比较无统计学意义(P＞0.05);≤50岁组和＞50岁组,组间比较无统计学意义(P＞0.05);左半大肠组和右半大肠组,组间比较无统计学意义(P＞0.05);管状组,管状-绒毛状组和绒毛状组,组间比较无统计学意义(P＞0.05);肿瘤直径＜1cm组,1-2cm组和＞2cm组,组间比较无统计学意义(P＞0.05);低级别上皮内瘤变组和高级别上皮内瘤变组,组间比较无统计学意义(P＞0.05)。6、独立组与癌旁组之间相同疾病p21Ras蛋白表达的Hscore评分和阳性细胞百分数比较均没有统计学意义(p＞0.05)。[结论]1、p21Ras蛋白表达出现于大肠癌发生的早期阶段(腺瘤),提示Ras基因与大肠癌的发生、发展密切相关。2、p21Ras蛋白在正常大肠组织和大肠的良性病变中几乎不表达,但在癌前病变和癌中的表达明显增加,提示KGH-R1可作为治疗性抗体进行开发和研究。