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目的:淋巴管转移是肺癌转移的重要途径,对于肺癌的分期、治疗及预后有重要意义,寻求有效抑制肺癌淋巴管生成的方法成为肺癌的治疗方法之一。我们的前期研究发现,金复康口服液可通过抑制骨髓间充质干细胞向肿瘤淋巴管内皮细胞分化抑制肿瘤生长,其机制可能与抑制基质细胞源性因子-1(stromal cell-derived factor 1,SDF-1)/C-X-C型趋化因子受体4(C-X-Cchemokine receptortype 4,CXCR4)信号轴有关。本实验利用CXCR4基因沉默后转染骨髓间充质干细胞,观察金复康口服液对肺癌的生长及淋巴管新生的作用,明确金复康基于抑制SDF-1/CXCR4轴调控淋巴管新生的抗肿瘤作用。方法:(1)提取C57BL/6小鼠原代骨髓间充质干细胞,构建CXCR4shRNA慢病毒载体,转染P3代骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSC),激光共聚焦显微镜观察细胞转染情况,寻找最佳移植时间。(2)RT-PCR检测4组慢病毒表达载体NC 组、CXCR4 shRNA 1 组、CXCR4 shRNA 2 组、CXCR4 shRNA 3 组对 BMMSC CXCR4基因的沉默效率。(3)免疫磁珠分选骨髓细胞中的造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)与CXCR4 shRNA慢病毒载体转染后的BMMSC混合(HSC 1×105/只,BMMSC2×105/只),经尾静脉回输给经致死剂量射线照射的C57BL/6受体小鼠,构建小鼠骨髓嵌合体模型,NC慢病毒载体组14只,CXCR4 shRNA慢病毒载体组20只。35天后激光共聚焦显微镜观察骨髓细胞涂片,观察嵌合体模型是否构建成功。(4)在骨髓嵌合体小鼠右侧腋下注射1×106/只Lewis肿瘤细胞,构建小鼠肺癌皮下移植瘤模型。实验共分为五组,每组6只小鼠,分别为:NC+金复康组、NC+NS组、CXCR4 shRNA+金复康组、CXCR4 shRNA+环磷酰胺组、CXCR4 shRNA+NS组。7天后按分组给药,NC+金复康组和CXCR4 shRNA+金复康组,每日金复康口服液灌胃0.4ml,连续给药21天;NC+NS组和CXCR4 shRNA+NS组,每日生理盐水灌胃0.4ml,连续给药21天;CXCR4 shRNA+环磷酰胺组,按照小鼠体重,以20mg/kg的剂量隔日腹腔注射环磷酰胺注射液,共10次。给药干预结束后处死小鼠,取其皮下移植瘤。(5)RT-PCR和Western Blot检测肿瘤组织中CXCR4 mRNA和蛋白质的表达。(6)制作肿瘤组织免疫荧光染色切片,激光共聚焦显微镜拍摄LVYE-1绿色荧光图片,骨髓来源的红色荧光细胞图片及蓝色DAPI染色的细胞核图片。结果:(1)重组CXCR4 shRNA慢病毒载体转染P3代骨髓间充质干细胞后第7天红色荧光强度最高,CXCR4在细胞中稳定表达,可用于移植。(2)RT-PCR结果显示CXCR4 shRNA2组慢病毒载体对于BMMSC的CXCR4基因沉默率最高。(3)构建小鼠骨髓嵌合体模型,激光共聚焦显微镜观察移植后35天小鼠骨髓涂片,结果显示CXCR4沉默组小鼠骨髓细胞红色荧光强度较空载组低(P<0.05)。(4)小鼠Lewis细胞皮下移植瘤平均重量分别为:NC+金复康组2.50g,NC+NS组3.32g,CXCR4 shRNA+金复康组1.09g,CXCR4 shRNA+环磷酰胺组0.94g,CXCR4 shRNA+NS组1.92g,沉默组小鼠肿瘤重量明显低于空载对照组(P<0.05),金复康给药组小鼠肿瘤重量亦低于对照组,环磷酰胺组小鼠肿瘤重量最低,具有统计学差异(P<0.05)。(5)空载组和沉默组小鼠肿瘤组织中总的CXCR4 mRNA和蛋白质的表达未见明显差异,金复康用药组CXCR4 mRNA和蛋白质的含量较对照组明显降低(P<0.05)。(6)CXCR4 shRNA+NS组和NC+NS组相比,肿瘤免疫荧光切片RFP+、LYVE-1+及RFP+/LYVE-1+双阳性细胞数均有显著减少(P<0.01),空载组中金复康口服液可减少RFP+、LYVE-1+及RFP+/LYVE-1+的数量(P<0.05),在沉默组中金复康和环磷酰胺对于LYVE-1+细胞有抑制作用(P<0.01),但两组中RFP+、RFP+/LYVE-1+双阳性细胞未见明显减少。结论:(1)沉默骨髓间充质干细胞CXCR4基因可减少BMMSC迁移至皮下移植瘤并且阻碍其转化为肿瘤组织的淋巴管内皮细胞。(2)沉默BMMSC CXCR4后不能抑制肿瘤组织中总的CXCR4 mRNA的表达和CXCR4蛋白的含量,金复康口服液可降低皮下移植瘤组织中CXCR4 mRNA的表达和CXCR4蛋白的含量。(3)金复康口服液对Lewis皮下移植瘤生长具有明显抑制作用,其机制可能是通过SDF-1/CXCR4轴抑制骨髓间充质干细胞向淋巴管内皮细胞转化。