研究背景心血管疾病是人类死亡的主要原因,各种危险因素导致的血管重构和动脉粥样硬化是常见的病理基础。临床和病理研究表明,动脉粥样硬化病变主要发生在血管分叉、弯曲以及狭窄区域,高血压可引起血管壁细胞增殖、血管壁增厚,介入治疗术后异常血流可引起血管增生和再狭窄。这些因素提示血管力学因素是血管重塑和动脉粥样硬化形成的重要诱因。血管重塑主要表现为血管平滑肌细胞（VSMCs）的异常增殖、凋亡和迁移。血管内皮细胞能够直接感受血流剪切力的刺激,通过细胞间的相互作用影响平滑肌细胞的功能。研究病理剪切力诱导血管重塑的分子机制以及内皮细胞和血管平滑肌细胞之间的相互作用有助于更好地理解心血管疾病的发病机制。近年来研究表明生物力学在新生内膜增生方面发挥了重要作用。DKK1蛋白,又称Dickkopf1,是一种分泌性糖蛋白,可通过旁分泌与自分泌发挥作用。一方面,DKK1通过与LRP6结合,从而拮抗下游Wnt通路发挥作用。另一方面,DKK1可以结合受体CKAP4,进而胞内段募集PI3K,激活Akt,促进增殖。既往研究中发现DKK1可通过调控CKAP4/PI3K/Akt、非经典Wnt/PCP/JNK以及β-catenin/MMP7通路促进肿瘤细胞增殖迁移及肿瘤存活。近年来,DKK1在心血管疾病中的作用受到关注,以DKK1为靶点的药物开发已进行到Ⅱ期临床试验。研究发现,DKK1与颈动脉内膜中层厚度呈正相关;接受双联抗血小板治疗的急性冠脉综合征患者中,DKK1水平与心血管事件和单独心血管死亡有独立相关性,内皮细胞与血小板来源的DKK1可通过抑制Wnt/β-catenin通路、活化NF-κB促进内皮细胞炎症反应,促进动脉粥样硬化。我们课题组前期研究发现,血清DKK1水平升高可作为急性冠脉综合征再发不良心血管事件的独立预测指标,联合危险因素显著提高预测价值。DKK1能够影响血管内皮细胞的功能。ox-LDL与病理剪切力均可上调血管内皮细胞DKK1表达,通过拮抗经典Wnt通路、激活JNK、促进脐静脉内皮细胞内质网应激,诱导凋亡,促进血流中单核细胞与内皮细胞黏附,并抑制内皮细胞间紧密连接分子的表达,从而促进动脉粥样硬化发生。在ApoE-/-小鼠中慢病毒过表达及沉默DKK1进一步证实,DKK1促进内皮细胞功能紊乱,促进斑块发生,增加斑块不稳定性。然而,DKK1对血管新生内膜形成的作用及机制尚未深入研究,DKK1受剪切力调节,剪切力干预下内皮细胞分泌的DKK1是否影响平滑肌细胞的功能,亦未见报道。本研究旨在研究剪切力-DKK1在内皮细胞-平滑肌细胞中对平滑肌增殖、迁移和新生内膜形成的影响及其潜在机制。研究目的1.探讨病理剪切力作用于内皮细胞分泌的DKK1是否影响平滑肌细胞的功能;2.检测内皮细胞DKK1蛋白缺失在低剪切力区域对血管新生内膜形成的影响;3.探索内皮细胞DKK1对血管新生内膜形成影响的潜在机制。研究方法1.采用CRISPR/Cas9法建立Tek-Cre-ERT/+/DKK1fl/fl条敲小鼠模型鉴于目前DKK1-/-小鼠胚胎致死,本课题采用CRISPR/Cas9法建立Tek-Cre-ERT/+/DKK1fl/fl（DKK1ECKO）条敲小鼠模型。2.小鼠颈动脉结扎模型的构建8-10周DKK1ECKO条敲小鼠及同窝对照DKK1fl/fl雄性小鼠行左侧颈动脉结扎制备血管低剪切力模型,21天后取材。3.动物取材小鼠麻醉,称量体重,固定。用1ml注射器于心尖取血,后续实验中检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）和高密度脂蛋白（HDL-C）水平。使用提前预冷的生理盐水充分灌流,留取小鼠心肝脾肺肾,仔细剥离主动脉及两侧颈动脉,根据后续实验分别置于组织固定液或液氮中保存。固定24小时后置于流水下冲洗6-8小时,程序脱水后石蜡包埋,然后做连续切片。4.细胞及组织蛋白提取（全程冰上操作）根据细胞密度每孔加入80-120μl细胞及组织裂解液（RIPA）,每20mg组织加入200μl含PMSF的RIPA（1:100）,充分剪碎组织,冰上静置10min,14000rpm 4℃条件下离心5min,上清加入5×Loading Buffer,99℃10min煮蛋白使其变性,然后置于-20℃冰箱中保存。5.蛋白质印迹法（Western Blot,WB）细胞或组织蛋白上样每孔10-15ul,电泳,转膜,一抗目的分子4℃摇床上孵育过夜,洗膜,根据种属来源孵育相应二抗后ECL化学显影,然后分析条带灰度值。6.组织切片染色颈动脉石蜡切片分别进行H&E染色、免疫组织化学染色及免疫荧光染色。测量结扎处颈动脉新生内膜面积、检测DKK1表达水平、检测PCNA及Ki67等增殖指标的表达水平。7.小鼠原代内皮细胞提取与培养4-5周大小的DKK1ECKO基因敲除小鼠及同窝对照DKK1fl/fl雄鼠用于提取小鼠主动脉内皮细胞、肺动脉内皮细胞。8.人原代平滑肌细胞HASMC以及脐静脉内皮HUVECs的培养内皮细胞和平滑肌细胞均购买于美国ScienCell公司,培养传代。9.细胞共培养本实验中细胞共培养下的剪切力加载系统由3个部分组成:（1）用于内皮细胞-平滑肌细胞联合培养的平行平板流动腔;（2）培养基灌流循环系统;（3）细胞培养箱。给予内皮细胞加载生理剪切力（12dyne/cm2）和病理性低剪切力（4dyne/cm2）。静止状态下的共培养采用Transwell小室,上层接种转染Lenti-GFP-DKK1慢病毒过表达DKK1的内皮细胞,下室接种平滑肌细胞。10.VSMC细胞迁移的检测采用细胞划痕实验评价rDKK1对平滑肌细胞迁移的影响。11.VSMC细胞增殖的检测采用EdU试剂盒检测rDKK1对平滑肌细胞增殖的影响。12.统计分析实验数据均以均数±标准差表示,应用SPSS 17.0软件分析数据。非配对t检验用于两样本间比较,多样本间比较应用ANOVA单因素方差分析,P<0.05为具有显著统计学差异。研究结果1.病理性低剪切力上调小鼠血管壁细胞中DKK1的表达小鼠体内在血管的平直段,单向的生理性脉冲剪切力起到血管保护作用;主动脉弓小弯侧等处主要为病理性的低剪切力及震荡剪切力,容易导致炎症、氧化应激反应和血栓形成。Western Blot结果显示主动脉弓小弯侧血管组织中DKK1的表达含量较胸主动脉直段显著升高（P<0.05）。说明在体内,自然状态下病理性低剪切力能够促进血管壁细胞中DKK1的表达。为进一步观察病理剪切力对血管壁细胞DKK1表达的影响,对小鼠行左侧颈总动脉结扎建立病理性低剪切力模型。结扎后48小时,通过Western Blot以及免疫荧光双染检测DKK1在血管壁细胞中的表达情况,结果均显示结扎组颈总动脉血管壁细胞中DKK1表达高于假手术组。以上结果说明,在体内病理剪切力能够上调血管壁细胞中DKK1的表达。2.病理性低剪切力干预下内皮细胞DKK1具有旁分泌作用在时间效应实验中,给予联合培养的内皮细胞病理性低剪切力刺激0、1、3、6、12、24h。与对照组相比,联合培养的内皮细胞受到病理性低剪切力作用后,内皮细胞中DKK1的mRNA表达上调（p<0.05）,而平滑肌细胞中DKK1的mRNA水平下调（p<0.05）。内皮细胞以及PET膜对侧平滑肌细胞中DKK1蛋白表达均上调（p<0.05）。两种细胞的培养上清中DKK1分泌量增多（p<0.05）。在强度-效应实验中,给予内皮细胞大小为12dyne/cm2的生理剪切力（Normal shear stress,NSS）以及大小为 4dyne/cm2 的病理性低剪切力（Low shear stress,LSS）刺激12小时。结果显示,与对照组相比,联合培养的内皮细胞受到病理性低剪切力作用后,内皮细胞中DKK1的mRNA表达上调（p<0.05）,而平滑肌细胞中DKK1的mRNA水平下调（p<0.05）。内皮细胞以及PET膜对侧平滑肌细胞中DKK1蛋白表达均上调（p<0.05）。两种细胞的培养上清中DKK1分泌量增多（p<0.05）。构建带有GFP标签的DKK1过表达慢病毒,转染内皮细胞并构建稳转株。Lenti-DKK1病毒转染的内皮细胞（上室）与平滑肌细胞（下室）共培养,24h后观察下室细胞荧光表达;发现共培养的平滑肌细胞内出现GFP荧光,提示内皮细胞分泌的DKK1可被共培养的平滑肌细胞摄取。3.病理性低剪切力干预下内皮细胞DKK1通过旁分泌作用对平滑肌细胞功能的影响在时间效应实验中,给予联合培养的内皮细胞病理性低剪切力刺激0、1、3、6、12、24h。Western blot检测平滑肌细胞中PCNA的表达水平。结果显示,与0h相比,病理性低剪切力促进平滑肌细胞PCNA的表达,3h开始升高,12h达峰,并持续至24h（p<0.05）。在强度-效应实验中,给予联合培养的内皮细胞大小为12dyne/cm2的生理剪切力（Normal shear stress,NSS）以及大小为4dyne/cm2的病理性低剪切力（Low shear stress,LSS）刺激12小时。结果显示,生理对照组相比,联合培养的内皮细胞受到病理性低剪切力作用后,平滑肌细胞中PCNA表达上调（p<0.05）。将前期实验获得的DKK1干扰稳转株内皮细胞与平滑肌细胞联合培养,给予内皮细胞病理性低剪切力刺激12h。Western blot检测平滑肌细胞中PCNA的表达水平。结果提示:干扰内皮细胞的DKK1,病理性低剪切力对平滑肌细胞增殖的促进作用被抑制（p<0.05）。中和抗体封闭实验:在进行剪切力加载前3h,在平滑肌细胞的培养液中加入10μg/ml DKK1的中和抗体。然后给予联合培养的内皮细胞病理性低剪切力12h。结果显示:使用DKK1中和抗体,病理性低剪切力对平滑肌细胞增殖的促进作用被抑制（p<0.05）。重组蛋白刺激实验:用不同浓度的rDKK1（0,25,50,100,150,200ng/ml）对平滑肌细胞进行刺激不同时间（0,1,3,6,12,24h）,增殖的标志物PCNA表达上调（P<0.05）。免疫荧光显示,与Con组相比,rDKK1组Ki67以及PCNA阳性细胞的比率增加。EdU结果:与Con组相比,rDKK1组EdU阳性细胞量升高。结果提示外源性DKK1具有促进平滑肌细胞的增殖作用。4.DKK1内皮条件性敲基因小鼠一般情况检测DKK1ECKO基因敲除小鼠及DKK1fl/fl对照组小鼠的TC、TG、LDL-C及HDL-C的血清水平,均无统计学差异,说明DKK1不影响敲基因小鼠的血脂。5.内皮细胞DKK1蛋白不参与维持小鼠的血管形态DKK1不影响小鼠的血管形态。实验选取未造模的5、6、7周龄DKK1ECKO组及对照组小鼠,每周龄组各3只,行颈动脉H&E染色,结果显示2组小鼠血管形态均正常且无显著差异。6.内皮细胞DKK1蛋白缺失抑制小鼠结扎血管的内膜新生HE染色显示,与同窝对照的小鼠相比,内皮细胞条件性敲除DKK1明显抑制了小鼠颈动脉结扎导致的病理性低剪切力区域的新生内膜形成（P<0.05）。7.内皮细胞DKK1蛋白缺失抑制血管平滑肌细胞的增殖体内EdU以及组织免疫荧光染色显示,内皮细胞条件性敲除DKK1明显抑制血管新生内膜中平滑肌细胞的增殖（P<0.05）。8.血管组织全基因组测序分析（RNA-seq）为了确定DKK1影响血管功能所涉及的分子特征和生物学过程,选取同窝生DKK1ECKO雄性小鼠与DKK1fl/fl雄性小鼠各6只,于8周龄时取材主动脉及颈动脉全长,2只同种小鼠血管为1个样本,进行血管组织全基因组测序分析。测序结果显示基因COX2及转录因子MYB的表达水平有明显差异。9.DKK1通过COX2促进平滑肌细胞的增殖测序结果可知DKK1基因的缺失可以下调COX2的表达。利用Real-time RT-PCR、Western Blot验证,得到的结果与测序结果一致。体外培养HASMCs,分别给予不同时间（0、1、3、6、12、24h）的人重组DKK1蛋白（rDKK1）（100ng/ml）刺激,COX2表达上调。siRNA转染干扰COX2,然后给与rDKK1刺激12h,Western Blot检测发现,与阴性对照组相比,rDKK1干预下HASMCs中PCNA的表达上调被抑制,说明COX2参与DKK1对平滑肌细胞增殖功能的调节。10.COX2是c-myb的靶基因,DKK1通过c-myb/COX2促进平滑肌细胞的增殖测序结果可知DKK1基因的缺失可以下调c-myb的表达。利用Real-time RT-PCR、Western Blot验证,得到的结果与测序结果一致。体外培养HASMCs,分别给予不同时间（0、1、3、6、12、24h）的人重组DKK1蛋白（rDKK1）（100ng/ml）刺激c-myb表达水平升高。利用siRNA转染干扰c-myb,然后给与rDKK1刺激6h,Western Blot检测发现,与阴性对照组相比,rDKK1干预下HASMCs中COX2的表达上调被抑制,说明DKK1能够通过c-myb调控COX2的表达。11.DKK1主要通过与平滑肌细胞表面的CKAP4受体结合,通过PI3K/AKT通路促进平滑肌细胞的增殖利用siRNA转染干扰DKK1的常见受体LRP6以及CKAP4,然后给予人重组蛋白DKK1干预12h,敲除受体CKAP4可显著抑制DKK1对平滑肌细胞增殖的促进作用（P<0.05）。AKT是受体CKAP4的下游通路,使用AKT通路的抑制剂可阻断外源性DKK1对平滑肌细胞增殖的促进作用,也可阻断DKK1对c-myb的促表达作用（P<0.05）。结论1.病理性低剪切力可增加内皮细胞分泌DKK1并促进平滑肌细胞的增殖;2.内皮细胞DKK1促进小鼠血管结扎导致的低剪切力作用区域新生内膜的形成;3.DKK1可通过c-myb/COX2促进平滑肌细胞的增殖。研究背景心血管疾病是人类死亡的主要原因,高血压是心血管疾病的主要危险因素。高血压常常伴随血管壁的机械力异常,包括牵张力和剪切力,而牵张力增加是主要的力学改变。牵张力的异常可引起血管壁细胞的形态和功能改变,从而造成血管结构和功能异常,促进动脉粥样硬化斑块形成、血管增生、动脉瘤,并加重高血压靶器官损害。因此,进一步研究明确高血压的发生和致病机制,对于减少心血管病事件具有重要意义。肾素-血管紧张素（RAS）系统在心血管疾病的发生发展中发挥重要作用,血管紧张素转化酶2（ACE2）是其关键组分之一。近年来,大量研究研究表明ACE2对心血管具有广泛的保护作用。ACE2是ACE的同源物,但在底物特异性上与ACE不同,ACE2能够裂解AngⅡ并产生血管扩张肽Ang（1-7）。ACE2在多种心血管疾病如心力衰竭、腹主动脉瘤和糖尿病肾病以及心脏纤维化等中发挥重要保护作用。我们实验室前期研究表明在ApoE-/-小鼠中慢病毒过表达及沉默ACE2进一步证实,ACE2能够抑制斑块发生发展,增加斑块稳定性。Dickkopf-1（DKK1）是一种多功能的分泌蛋白,Wnt信号通路抑制剂,最初在肿瘤学研究中发现DKK1在肺癌、结肠癌等肿瘤的发生起重要作用,并作为药物开发靶点进行二期临床研究。近期临床研究表明,DKK1与心血管疾病关系密切。我们课题组前期研究发现,不良心血管事件发生率随DKK1水平升高增加,DKK1联合hs-CRP与GRACE危险评分可以提高对ACS患者再发心血管事件的预测价值;进一步研究证明DKK1能够促进斑块形成,增加斑块不稳定性。近期研究发现DKK1参与牵张力对平滑肌细胞增殖、迁移的调节作用,进而参与到牵张力对平滑肌细胞功能的影响和血管壁重构,但机制尚未见报道。关于机械刺激调节血管细胞中ACE2表达的机制尚需深入研究。牵张力是否通过调控平滑肌细胞DKK1从而影响ACE2的表达,进而影响平滑肌细胞的功能,亦未见报道。研究目的1.明确病理性牵张力对平滑肌细胞ACE2、DKK1表达的影响;2.探讨ACE2对病理牵张力诱导的的人主动脉平滑肌细胞功能影响;3.探讨DKK1在牵张力调控平滑肌细胞ACE2表达中的作用。研究方法1.人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）的培养与处理人主动脉平滑肌细胞均购买于美国ScienCell公司,培养传代。2.动物模型的建立与取材对大鼠行腹主动脉缩窄术建立病理牵张力模型,随机分为腹主动脉缩窄组和假手术对照组,造模后3、5及7天后取材。将大鼠麻醉,称量体重后将其固定于泡沫板上。使用提前预冷的生理盐水充分灌流,留取小鼠心肝脾肺肾,仔细剥离主动脉及两侧颈动脉,根据后续实验分别置于组织固定液或液氮中保存。固定24小时后置于流水下冲洗6-8小时,程序脱水后石蜡包埋,然后做连续切片。3.细胞及组织蛋白提取（全程冰上操作）根据细胞密度每孔加入80-120μ1细胞及组织裂解液（RIPA）,每20mg组织加入200μl含PMSF的RIPA（1:100）,充分剪碎组织,冰上静置10min,14000rpm 4℃条件下离心5min,上清加入5×Loading Buffer,99℃ 10min煮蛋白使其变性,然后置于-20℃冰箱中保存。4.蛋白质印迹法（Western Blot）细胞或组织蛋白上样每孔10-15ul,电泳,转膜,一抗目的分子4℃摇床上孵育过夜,洗膜,根据种属来源孵育相应二抗后ECL化学显影,然后分析条带灰度值。5.酶联免疫吸附测定（ELISA）牵张力加载结束后,收集不同组中平滑肌细胞的培养上清液,ELISA法检测上清中DKK1,Ang1-7及Ang Ⅱ的含量。6.EdU检测平滑肌细胞增殖采用EdU试剂盒检测ACE2在调节病理牵张力调节平滑肌细胞增殖中的作用。7.细胞划痕实验用细胞划痕实验检测ACE2在病理牵张力调节平滑肌迁移中的作用。8.流式细胞术检测细胞凋亡采用Annexin V/PI染色,通过流式细胞术检测ACE2在介导病理牵张力调节平滑肌细胞凋亡中的作用。9.细胞转染利用 Invitrogen 公司的 Lipo3000 分别转染DKK1 siRNA、ATF3 siRNA、Negtive control siRNA,检测ACE2的表达变化,验证DKK1及ATF3是否参与病理牵张力对ACE2的表达调节。10.双荧光素酶报告实验分别构建不同长度的ACE2启动子序列。将ATF3过表达质粒或ATF3 siRNA和ACE2启动子序列共转染HEK293工具细胞,双荧光素酶报告实验检测荧光表达强度。明确ATF3与ACE2基因的启动子结合。11.组织切片染色腹主动脉切片分别进行苏木素-伊红染色（H&E）、免疫组织化学染色。检测DKK1、ACE2表达水平。同时观察人体组织的血管,比较高血压与非高血压血管ACE2与DKK1的表达。12.人体血管组织的获取研究方案由山东大学齐鲁医院科研伦理委员会批准科研伦理号:KYLL-2021-121。13.统计分析实验数据均以均数±标准差表示,应用SPSS 17.0软件分析数据。非配对t检验用于两样本间比较,多样本间比较应用ANOVA单因素方差分析,P<0.05为具有显著统计学差异。结果1.在体大鼠腹主动脉缩窄影响ACE2和DKK1的表达免疫组化与Western Blot结果均显示:与假手术组相比,大鼠腹主动脉缩窄后,血管壁细胞中ACE2表达下降（P<0.01）,DKK1以及ACE表达升高（P<0.01）。2.在高血压患者观察血管壁ACE2、DKK1的表达情况人体血管免疫组化染色显示:高血压患者血管壁平滑肌细胞中的ACE2表达均显著降低,DKK1的表达明显升高。3.病理牵张力调节血管平滑肌细胞中DKK1,ACE2/Ang-（1-7）和ACE/AngⅡ的表达给予平滑肌细胞不同时间（0,3,6,12,24h）18%机械牵张力刺激,同0h相比,18%机械牵张力能够抑制ACE2的表达（p<0.05）;促进ACE以及DKK1的表达（p<0.05）。18%机械牵张力促进AngⅡ及DKK1分泌（P<0.01）,抑制Ang（1-7）分泌（P<0.01）。4.ACE2对病理牵张力诱导的的人主动脉平滑肌细胞功能影响通过EdU检测病理牵张力干预下ACE2过表达对平滑肌细胞增殖的影响,结果显示:与静止组相比,18%病理牵张力促进平滑肌细胞的增殖（P<0.01）;ACE2过表达可抑制平滑肌细胞增殖（P<0.05）;通过细胞划痕实验检测病理牵张力干预下ACE2过表达对平滑肌细胞迁移能力的影响,结果显示:与静止组相比,18%病理牵张力促进平滑肌细胞的迁移（P<0.01）;ACE2过表达可抑制平滑肌细胞迁移（P<0.05）;通过流式细胞术检测病理牵张力干预下ACE2过表达对平滑肌细胞凋亡的影响,结果显示:与静止组相比,18%病理牵张力促进平滑肌细胞的凋亡（P<0.01）;ACE2过表达可抑制平滑肌细胞凋亡（P<0.05）;通过Western Blot检测病理牵张力干预下ACE2过表达对平滑肌细胞胶原合成的影响,结果显示:与静止组相比,18%病理牵张力促进平滑肌细胞胶原Ⅰ,胶原Ⅲ的表达（P<0.01）;ACE2过表达可抑制平滑肌细胞胶原Ⅰ,胶原Ⅲ的合成（P<0.05）:5.病理牵张力通过p38/DKK1调控ACE2的表达为了探讨DKK1是否参与病理牵张力对人主动脉平滑肌细胞中ACE2的调节作用,利用小干扰转染干扰DKK1表达,Western Blot检测发现,与阴性对照组相比,病理牵张力干预下HASMCs中ACE2的下调被抑制（p<0.05）。给予平滑肌细胞抗DKK1中和抗体处理,也可抑制病理性牵张力对平滑肌细胞中ACE2的下调。以上结果提示,DKK1参与介导病理牵张力对平滑肌细胞中ACE2的表达调节（p<0.05）。病理牵张力诱导p38 MAPK、JNK和ERK1/2磷酸化（P<0.05）。p38 MAPK抑制剂SB203580显著减弱了病理牵张力诱导的ACE2下调（P<0.05）。给予平滑肌细胞病理牵张力刺激时,DKK1表达增加,SB203580阻断了病理牵张力对DKK1的上调作用（P<0.05）。以上结果提示,病理牵张力通过p38 MAPK促进DKK1的表达与分泌,进而调控ACE2的表达。6.病理牵张力通过ATF3调控ACE2的表达给予平滑肌细胞病理牵张力刺激时,ATF3表达增加,免疫荧光染色显示18%病理牵张力促进ATF3的核转位。利用小干扰转染干扰ATF3的表达,发现ATF3的敲低逆转了病理牵张力下调的 ACE2 水平（P<0.05）。以上结果提示,病理牵张力促进ATF3的表达增高,并促进转位进入细胞核来调控ACE2的表达。7.外源性DKK1可通过ATF3调控ACE2的表达使用体外培养HASMCs,分别给予不同时间（0、1、3、6、12、24h）的人重组 DKK1 蛋白（rDKK1）（100ng/ml）刺激。与 0h 相比,rDKK1 刺激 6h 后 ACE2蛋白表达水平即明显下调,持续至24h（p<0.05）。使用体外培养HASMCs,分别给予不同时间（0、15、30、60、120、180min）的人重组DKK1蛋白（rDKK1）（100ng/ml）刺激。由于ATF3是一种快速反应蛋白,因此我们使用较短的时间梯度。与0h相比,rDKK1刺激15min即可明显促进ATF3的表达,30min达到高峰（p<0.05）。然后,利用小干扰转染干扰ATF3的表达,发现ATF3的敲低逆转了 DKK1下调的ACE2水平（P<0.05）。8.ACE2是ATF3的靶基因为了进一步确定ATF3是否直接能够调节ACE2的表达,我们利用JASPAR数据库（jaspar.genereg.net）分析了 ACE2启动子序列区域中ATF3潜在的结合位点。双荧光素酶基因报告实验证实,ATF3可调控ACE2的转录活性。ChIP实验结果进一步验证了 ATF3与ACE2基因的这个转录区域结合。结论1.病理性牵张力促进血管平滑肌细胞DKK1表达,抑制ACE2表达;2.ACE2参与病理性牵张力对平滑肌细胞增殖、迁移等功能的作用;3.病理性牵张力可通过促进平滑肌细胞DKK1的分泌进而抑制ACE2的表达;4.病理牵张力通过p38/DKK1/ATF3调控ACE2的表达,ACE2是转录因子ATF3的靶基因。