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目的：研究Ki67启动子调控的荷载Ki67-siRNA、hTERT-siRNA及Ki67-siRNA+hTERT-siRNA(double-siRNA)的条件增殖型腺病毒对肾癌的体外治疗效果。
方法：Ki67-ZD55、Ki67-ZD55-Ki67-siRNA、Ki67-ZD55-hTERT-siRNA、Ki67-ZD55-double-siRNA腺病毒大量扩增后测定滴度；将上述四种腺病毒分别感染肾癌KETR-3、786-O、ACHN细胞及正常HK-2细胞，Western Blot检测腺病毒E1A蛋白在细胞中的表达情况；TCID50检测腺病毒在细胞中的复制能力；RT-PCR检测腺病毒对细胞中Ki67基因、hTERT基因的沉默效果；免疫细胞化学检测腺病毒对细胞中Ki67蛋白及hTERT蛋白表达的抑制情况；CCK-8法检测腺病毒对细胞增殖的影响；Annexin V-FITC/PI法检测腺病毒对细胞凋亡的影响；结晶紫染色检测腺病毒的细胞毒性作用。
结果：1.在肾癌KETR-3、786-O、ACHN细胞中，四组病毒均表达E1A蛋白，同一细胞中Ki67-ZD55-double-siRNA组E1A蛋白表达量较Ki67-ZD55组、Ki67-ZD55-Ki67-siRNA组及Ki67-ZD55-hTERT-siRNA组E1A蛋白表达量多，P<0.05，差异有统计学意义，其病毒复制能力也最强，Ki67-ZD55-Ki67-siRNA组及Ki67-ZD55-hTERT-siRNA组E1A蛋白表达量较Ki67-ZD55组E1A蛋白表达量多，P<0.05，差异有统计学意义，Ki67-ZD55的病毒复制能力也最弱，而Ki67-ZD55-Ki67-siRNA组及Ki67-ZD55-hTERT-siRNA组E1A蛋白表达量无差异(P>0.05)；在KETR-3、786-O、ACHN细胞中四种病毒E1A蛋白表达量是逐渐降低的，四种病毒在KETR-3细胞中显示最强的复制能力，在786-O细胞中其次，在ACHN细胞中最弱；在HK-2细胞中未检测到E1A蛋白的表达，四种病毒也无复制能力。
2.RT-PCR检测结果与免疫细胞化学结果显示在肾癌KETR-3、786-O、ACHN细胞中，Ki67-ZD55-double-siRNA组及Ki67-ZD55-Ki67-siRNA组的Ki67 mRNA的表达和蛋白的表达均明显降低，与其它组和对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；Ki67-ZD55-double-siRNA组及Ki67-ZD55-hTERT-siRNA组的hTERT mRNA的表达和蛋白的表达均明显降低与其他组和对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；四种腺病毒在KETR-3细胞中作用最明显，在786-O细胞中作用其次，在ACHN细胞中作用较弱；在HK-2细胞中，各组的Ki67及hTERT的mRNA的表达和蛋白的表达无差异(P>0.05)。
3.CCK-8法、结晶紫染色法及AnnexinV-FITC/PI法显示四种病毒对肾癌KETR-3、786-O、ACHN细胞均有杀伤作用、增殖抑制作用和诱导细胞凋亡的作用，且CCK-8法显示病毒对细胞增殖的抑制作用与病毒的浓度及感染时间存在正相关性，其中Ki67-ZD55-double-siRNA组对肾癌细胞的杀伤作用、增殖抑制作用和诱导细胞凋亡的作用最强，P<0.05，差异有统计学意义；Ki67-ZD55-Ki67-siRNA组及Ki67-ZD55-hTERT-siRNA组作用其次，两组间无差异(P>0.05)；Ki67-ZD55组对肾癌细胞的杀伤作用、增殖抑制作用和诱导细胞凋亡的作用最弱，P<0.05，差异有统计学意义。四种腺病毒在KETR-3细胞中作用最明显，在786-O细胞中作用其次，在ACHN细胞中作用较弱；四种病毒对HK-2细胞均无明显杀伤作用、增殖抑制作用作用和诱导细胞凋亡的作用。
结论：成功构建的携带Ki67启动子、Ki67-siRNA及hTERT-siRNA的条件增殖型腺病毒Ki67-ZD55、Ki67-ZD55-Ki67-siRNA、Ki67-ZD55-hTERT-siRNA、Ki67-ZD55-double-siRNA可在表达Ki67的肾癌细胞内大量扩增，除了发挥自身的溶瘤作用外，还可高效表达Ki67-siRNA、hTERT-siRNA，从而进一步增强了其抑制肾癌细胞增殖、促进肾癌细胞凋亡的作用；携带Ki67启动子上述腺病毒，表现出更强的靶向性和生物学活性。本研究为肿瘤的生物治疗提供了一个新的思路，为本实验的体内实验部分提供了可行性依据。