论文部分内容阅读
目的:研究浒苔多糖(Enteromorpha’s polysaccharide,EP)对四氯化碳所致肝损伤的保护作用及其可能机制。方法:1、以雄性ICR小鼠为实验对象,将84只小鼠随机分为6组:正常组(Normal),模型组(Model),浒苔多糖低剂量组(LCEP)、浒苔多糖中剂量组(MCEP)、浒苔多糖高剂量组(HCEP)及阳性对照组(Silymarin)。Normal组和Model组灌胃(Intragastric administration,ig)生理盐水;LCEP、MCEP、HCEP组分别ig给予150mg/kg、300 mg/kg、450 mg/kg的浒苔粗多糖的水溶液;Silymarin组给予140mg/kg水飞蓟素水分散液,ig剂量均为10 m L/kg体重(body weight,B.W),灌胃时间为28d。6组均采用基础饲料喂养。末次给药1 h后腹腔注射(Intraperitoneal injection,ip)0.1%四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)橄榄油溶液,撤饲料,禁食不禁水16 h。眼球取血并计算肝脏系数。2、测定血清中谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate transaminase,AST)、总胆红素(Total bilirubin,TBIL)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)指标值,苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)观察肝脏组织结构,末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记测定法(Terminal dexynucleotidyl transferase(Td T)-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL)计数肝组织细胞凋亡率。肝匀浆,并测定其中的谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPx)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、过氧化氢酶(Catalase from micrococcus lysodeiktic,CAT)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)等生化指标。3、实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)测定肝组织中Nrf2、NQO-1、CSE、CBS、3-MST、TLR2、TLR4、TLR9、NF-k B p65、IL-1β、TNF-α、TGF-β、Pin1、Fas、Fasl、Bax、Bcl-2基因的表达量。蛋白质印迹法(Western-Blot)测定胱硫醚-γ-裂解酶(Cystathionine-γ-lyase,CSE)、胱硫醚-β-合成酶(Cystathionine-β-synthase,CBS)、单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)、环氧化酶-2(Cyclooxgenase-2,COX-2)、核因子E2相关因子2(Nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)、p-Nrf2、血红素氧化酶-1(Heme oxygennase-1,HO-1)、含热蛋白结构域3受体(Nucleotide-binding oligomerization domain like receptor family,pyrindomain containing 3,NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Cysteine aspartic acid specific protease-1,Caspase-1)、消化道皮肤素D(Gasdermin D,GSDMD)、Cleaved Gasdermin D蛋白表达水平。结果:1、CEP对CCl4致小鼠急性肝损伤的宏观水平保护作用采用0.1%CCl4橄榄油溶液一次性腹腔注射后,与Normal组相比,Model组小鼠肝脏系数、血清ALT和AST酶活性、TBIL、H2S含量较高(P<0.05);血清BUN含量较低(P<0.01);肝组织病理学检查可见肿胀的肝细胞、消失或者固缩的细胞核、炎症细胞浸润,细胞凋亡率较高(P<0.01);肝组织GPx、SOD、CAT活性、GSH含量较低(P<0.01),LDH活性、MDA含量较高(P<0.05)。与Model组相比,LCEP、MCEP、HCEP组及Silymarin组肝脏系数、血清ALT和AST酶活性、TBIL、H2S含量较低(P<0.05),肝组织GPx、SOD、CAT活性、GSH含量较高(P<0.05),LDH活性、MDA含量较低(P<0.05),肝组织病理学检查可见肿胀的肝细胞、少量炎症细胞浸润,细胞凋亡率较低(P<0.01)。2、CEP对CCl4致小鼠急性肝损伤的分子水平保护作用与Normal组相比,Model组小鼠HO-1、CSE、CBS、TLR2、LTR4、TLR9、Pin1、NF-k B p65、TNF-α、TGF-β、Fas、Bax、IL-1β基因表达量较高(P<0.05);肝组织中CSE、CBS、i NOS、COX-2、IL-6、MCP-1、NLRP3、Caspase-1、Gasdermin D、Cleaved Gasdermin D蛋白表达量较高(P<0.001);p-Nrf2、HO-1蛋白表量及p-Nrf2与Nrf2蛋白表达的比值较低(P<0.001);Nrf2、NQO-1、3-MST、Fasl、Bcl-2基因表达量及Nrf2蛋白表达量差异不显著(P>0.05)。与Model组相比,LCEP、MCEP、HCEP组及Silymarin组CSE、CBS、TLR2、LTR4、Pin1、NF-k B p65、TNF-α、TGF-β、Fas、Bax、IL-1β基因表达量较低(P<0.05),MCEP、HCEP组NQO-1基因的表达量较高(P<0.05),Silymarin组Bax基因低于Model组(P<0.05),但仍高于Normal组(P<0.05),HCEP组TLR2、TLR4基因的表达量低于Normal组(P<0.05);LCEP、MCEP、HCEP组及Silymarin组CSE、CBS、i NOS、COX-2、IL-6、MCP-1、NLRP3、Caspase-1、Gasdermin D、Cleaved Gasdermin D蛋白表达量较低(P<0.05);p-Nrf2、HO-1蛋白表量及p-Nrf2与Nrf2蛋白表达的比值较高(P<0.05);Nrf2、3-MST、TLR9、Fasl、Bcl-2基因表达量及Nrf2蛋白表达量差异不显著(P>0.05)。结论:1、本实验条件下,采用0.1%CCl4橄榄油溶液可以建立小鼠急性肝损伤模型,可以升高小鼠体内转氨酶的活性以及血清中总胆红素、减少血尿素氮含量,引起小鼠肝脏系数的增高,出现明显的肝组织损伤的病理改变。2、浒苔多糖可以明显减轻CCl4所致的急性肝损伤状态,可以降低血清中的转氨酶活性和总胆红素、增加血尿素氮含量,降低肝脏系数,改善肝组织的病理生理状态。3、CCl4致小鼠急性肝损伤可能跟其抑制机体内抗氧化防御系统有关,而浒苔多糖可通过加强机体内抗氧化防御系统,改善肝损伤病理生理状态。4、浒苔多糖可能通过Nrf2通路发挥抗氧化作用。5、CCl4通过H2S/CSE、H2S/CBS体系增加血清中H2S含量,浒苔多糖干预可通过该体系减弱该过程。6、CCl4可以通过Pin1/NF-k B通路发挥致肝损伤作用,浒苔多糖可通过该通路发挥抗肝损伤作用。7、浒苔多糖可以通过TLRs/NF-k B通路发挥抗肝损伤作用。8、CCl4可通过Fas/Fasl、Bax/Bcl-2通路,引起小鼠肝组织凋亡,浒苔多糖可以通过这两条通路发挥抗凋亡作用。9、CCl4可能通过NLRP3/Caspase-1/Gasdermin D信号通路引起小鼠肝组织细胞焦亡,浒苔多糖可能通过该通路拮抗这种作用。