HMGB1/BRG1在实验性矽肺上皮细胞间质转化中的作用与机制

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目的通过构建体外上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)模型以及小鼠矽肺模型,探索高迁移率族蛋白1(high-mobility group protein box 1,HMGB1)和Brahma相关基因1(brahma related genes 1,BRG1;SMARCA4)在矽肺进程中的作用与机制及甘草酸(Glycyrrhizic acid,Gly)对矽肺中EMT进程的影响,为探索矽肺的发病机制及干预措施提供新的思路和参考依据。方法1 HMGB1和BRG1对A549细胞和BEAS-2B细胞EMT作用与机制的体外观察使用A549细胞和BEAS-2B细胞构建体外EMT模型。用含TGF-β1的培养基刺激A549细胞和BEAS-2B细胞构建EMT模型,之后沉默HMGB1,或者沉默BRG1并上调HMGB1,以及不同浓度的甘草酸溶液刺激细胞,通过Western blot和RT-qPCR检测EMT标志物、HMGB1、BRG1的表达变化,以及对磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt/哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)通路的调控作用;通过划痕实验检测细胞迁移能力的变化。通过String数据库分析预测可能与HMGB1相互作用的蛋白。采用免疫荧光实验观察HMGB1与BRG1在细胞中的定位以及免疫共沉淀实验验证二者的相互作用。2 HMGB1和BRG1在小鼠矽肺EMT中表达变化及甘草酸干预效果观察使用C57BL/6N小鼠构建实验性矽肺模型。将36只C57BL/6N小鼠随机分为对照组、矽肺模型组(Si O2组)、溶剂对照组(Si O2+DMSO组)、甘草酸组(Si O2+Gly组)。对Si O2组、Si O2+DMSO组和Si O2+Gly组中的小鼠进行非暴露式气管滴注法滴注Si O2悬浊液,建立矽肺模型,对照组滴注等量生理盐水。随后每天对Si O2+Gly组中的小鼠腹腔注射甘草酸溶液,Si O2+DMSO组腹腔注射等量溶剂。收集小鼠肺组织,通过HE和Masson染色观察小鼠肺组织病理改变及纤维化程度;通过免疫组织化学、Western blot和RT-qPCR检测纤维化指标、EMT标志物和HMGB1、BRG1的表达变化情况以及对PI3K/Akt/m TOR通路的影响。3统计学分析使用SPSS 25.0进行实验数据处理。使用独立样本t检验进行两组间比较,使用单因素方差分析进行多组间均数比较,使用LSD检验进行组间两两比较,检验水准为双侧α=0.05,用均数±标准差((?)±s)表示其结果。结果1体外细胞EMT模型构建及HMGB1和BRG1对EMT过程的作用与机制1.1 A549细胞和BEAS-2B细胞EMT模型构建以及EMT标志物及相关指标的变化RT-qPCR和Western blot结果显示,和空白对照组相比,TGF-β1刺激组E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)表达水平升高,N-钙黏蛋白(N-cadherin,N-cad)、Vimentin和α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达上水平升高;同时,HMGB1和BRG1表达水平升高(P<0.05)。1.2沉默HMGB1可抑制肺上皮细胞的EMT的进展及BRG1的表达RT-qPCR和Western blot结果显示,si-HMGB1+TGF-β1刺激组相比于si NC+TGF-β1刺激组,E-cad表达水平升高,N-cad、Vimentin、α-SMA和BRG1表达水平降低,而且PI3K/Akt/m TOR通路也受到抑制(P<0.05)。划痕实验结果表明,沉默HMGB1后A549细胞和BEAS-2B细胞迁移能力降低(P<0.05)。1.3 HMGB1与BRG1在A549细胞和BEAS-2B细胞中的共定位以及相互作用关系。String数据库预测结果显示,可能与HMGB1有相互作用的蛋白包括BRG1。免疫荧光实验结果显示,HMGB1与BRG1在A549细胞和BEAS-2B细胞中存在共定位。免疫共沉淀结果显示,用带有BRG1特殊标记的磁珠富集能沉淀HMGB1;用标记的HMGB1的磁珠富集蛋白,BRG1蛋白条带也能被检测到。1.4沉默BRG1可抑制TGF-β1和rh HMGB1诱导的EMT样改变RT-qPCR和Western blot结果显示,和si NC+TGF-β1组相比,si BRG1+TGF-β1组中N-cad、Vimentin、α-SMA的表达水平明显降低,PI3K/Akt/m TOR通路也受到明显抑制(P<0.05);和si NC+rh HMGB1组相比,si BRG1+rh HMGB1组中E-cad的表达水平明显升高,N-cad、Vimentin和α-SMA的表达水平明显降低,PI3K/Akt/m TOR通路也受到抑制(P<0.05)。划痕实验结果显示,沉默BRG1后A549细胞和BEAS-2B细胞迁移能力降低,但上调HMGB1又促进细胞的迁移(P<0.05)。1.5不同浓度甘草酸可抑制肺上皮细胞EMT进程Western blot检测结果显示,和未加甘草酸细胞相比,甘草酸干预组中E-cad的表达水平有不同程度的升高,N-cad、Vimentin、α-SMA、HMGB1和BRG1的表达水平有不同程度的降低,差异有统计学意义(P<0.05)。2小鼠矽肺模型的建立以及甘草酸的干预效果2.1小鼠肺组织的病理改变HE和Masson结果显示,与对照组相比,SiO2组和SiO2+DMSO组中小鼠的肺泡结构损伤较严重,可以看到炎性浸润、细胞性结节和胶原纤维增生;与Si O2组和Si O2+DMSO组相比,Si O2+Gly组中的小鼠肺泡损伤相对较轻,炎性浸润和细胞性结节较少,纤维增生相对较轻。2.2甘草酸对EMT进程的影响免疫组织化学、RT-qPCR和Western blot检测结果显示,与对照组相比,Si O2组和Si O2+DMSO组中FN1和COL1A1表达水平明显升高(P<0.05),且E-cad表达水平明显降低,N-cad、Vimentin、α-SMA表达水平均明显升高(P<0.05);与Si O2组和Si O2+DMSO组相比,Si O2+Gly组中,FN1和COL1A1的表达水平明显降低,E-cad蛋白表达水平明显升高,N-cad、Vimentin、α-SMA表达水平均明显降低(P<0.05)。2.3甘草酸对HMGB1、BRG1以及PI3K/Akt/m TOR通路的影响免疫组化、RT-qPCR和Western blot检测结果显示,与对照组相比,Si O2组和Si O2+DMSO组中HMGB1和BRG1表达水平明显升高(P<0.05),PI3K/Akt/m TOR的表达水平也明显升高(P<0.05);与Si O2组和DMSO组相比,Si O2+Gly组中HMGB1和BRG1的表达水平明显降低,PI3K/Akt/m TOR通路的表达也受到抑制(P<0.05)。结论HMGB1与BRG1相互作用,通过激活PI3K/Akt/m TOR通路,促进肺上皮细胞EMT进程;甘草酸能够通过抑制HMGB1的表达而影响BRG1与PI3K/Akt/m TOR通路,延缓小鼠矽肺的进展。
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