目的证实可注射支架材料与种子细胞构建组织工程髓核能够修复椎间盘缺损,阻止椎间盘进一步退变,修复已经退变椎间盘,为退变性椎间盘疾病的治疗开辟一条新的有效途径。方法1.种子细胞培养鉴定及筛选1.1兔椎间盘髓核细胞的体外分离培养及鉴定取健康2周龄新西兰兔椎间盘髓核细胞,在含有15%灭活FBS的DMEM/F12培养液中培养,倒置相差显微镜下观察原代和传代细胞形态。分别在取材后、第1代、第2代细胞培养期间,进行髓核细胞活力测定;爬片培养后进行甲苯胺蓝、HE、聚集蛋白聚糖番红O、I型胶原和II型胶原免疫组织化学染色,光镜镜下观察;MTT法绘制髓核细胞生长曲线,并行透射电镜观察,对细胞体外的生物学特性进行研究。1.2兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养及鉴定无菌条件下抽取健康幼年新西兰兔胫骨骨髓2ml,经密度梯度离心后获取骨髓间充质干细胞,接种至100ml玻璃培养瓶中进行体外培养,观察其细胞形态、贴壁率和超微结构,流式细胞仪检测细胞表面标记物及细胞生长周期,并进行成骨诱导反向证明,对细胞体外的生物学行为进行研究。1.3比较上述两种细胞优缺点,筛选出最适合的种子细胞进行下一步实验2.可注射式组织工程髓核的构建及其生物学功能检测种子细胞与壳聚糖水凝胶复合形成可注射式组织工程髓核;细胞计数检测细胞在凝胶中存活情况;组织工程髓核II型胶原蛋白及蛋白聚糖免疫组化染色。3.经后路兔椎间盘髓核穿刺抽吸术建立椎间盘退变模型模拟人后路显微内窥镜椎间盘摘除术,穿刺抽吸髓核,建立椎间盘退变模型。4.可注射式组织工程髓核移植治疗椎间盘退变可注射式组织工程髓核注射移植入动物退变椎间盘内,分别于术后4周、8周处死实验动物,对相应椎间盘进行组织学及基因表达情况检测。结果1.种子细胞培养鉴定及筛选1.1兔髓核细胞:1、倒置相差显微镜观察见原代髓核细胞呈类圆形,折光较强,5 d始有细胞贴壁,细胞呈多角形或短梭形,6～8 d细胞生长进入指数期,约17 d时,细胞长满瓶壁,可进行传代,随传代次数增加,细胞形态逐渐由多角形、短梭形向长梭形改变;2、髓核细胞活力测定表明细胞在刚分离完成后活力约95%～97%,原代培养期间细胞活力为98%～100%,第1代培养期间细胞活力一般仍能维持为100%,第2代细胞活力下降较为明显,约为75%～80%;3、髓核细胞甲苯胺蓝染色呈强阳性,HE染色见细胞核、细胞质着色明显,原代、第1代髓核细胞I型胶原蛋白免疫细胞化学染色均呈阴性,II型胶原蛋白免疫细胞化学染色呈阳性,聚集蛋白聚糖番红O染色呈阳性反应,而第2代髓核细胞I型胶原蛋白免疫细胞化学染色阳性,II型胶原蛋白免疫细胞化学染色呈弱阳性,聚集蛋白多糖番红O染色着色较浅;4、MTT生长曲线与体外细胞培养时生长过程相符;5、细胞透射电镜显示原代髓核细胞内线粒体少,细胞质内有大量糖原颗粒,随传代次数增加,糖原颗粒减少,线粒体数量增多,细胞器开始肿胀。1.2兔骨髓间充质干细胞:1、兔骨髓间充质干细胞在体外培养2h后开始贴壁,20h后细胞基本贴壁完全,15d左右细胞融合达90%以上;2、透射电镜观察显示分离培养的兔骨髓间充质干细胞细胞表面可见许多微绒毛,主要分布于胞体一侧,胞核不规则,有切迹,细胞器丰富,具有典型未分化细胞特点;3、流式细胞仪检测显示分离培养的兔骨髓间充质干细胞表面标记物CD44、CD90表达呈阳性,CD45表达呈阴性,且绝大多数(约占细胞总数的97%)细胞的生长周期处于G1或G2期;4、成骨性诱导3周后,骨髓间充质干细胞逐渐形成小的钙盐结晶体,细胞碱性磷酸酶染色呈阳性,Von Kossa染色显示细胞聚集处存在大量钙盐,呈黑色沉积。1.3筛选结果:骨髓间充质干细胞较髓核细胞取材方便,体外培养扩增容易,适合作为组织工程髓核的种子细胞。2.可注射式组织工程髓核的构建及生物学功能检测骨髓间充质干细胞可以在壳聚糖水凝胶中生长增殖,并向类髓核细胞分化,II型胶原蛋白及蛋白聚糖免疫组化染色阳性。3.经后路兔椎间盘髓核穿刺抽吸术建立椎间盘退变模型3.1退变椎间盘HE染色观察退变4周的椎间盘可见髓核内出现多个裂隙,髓核内细胞显示软骨细胞化生,髓核与内层纤维环交界处细胞可见核代偿性增大,纤维环内层纤维中度扭曲和裂隙形成,伴有内层纤维环轻度向椎间盘凸入,按Nishimura标准分级为2-3级。退变8周后见髓核细胞基本消失,部分中央髓核区域缺如,可见较多形态类似成纤维细胞的细胞,纤维环纤维重度向椎间盘内凸入,呈指状突起,伸展至髓核内部,甚至髓核与内层纤维环结构不清,按Nishimura标准分级为4-5级。3.2退变椎间盘II型胶原蛋白免疫组化染色退变组4周染色见整个椎间盘呈现出淡黄色样,髓核中央深黄褐色阳性反应不明显,整个椎间盘结构不清,退变组8周后再次行II型胶原蛋白免疫组化见中央髓核区域阳性反应不明显,结构紊乱。4.可注射式组织工程髓核移植治疗椎间盘退变1、正常对照组及移植组椎间盘HE染色显示椎间盘结构清晰,髓核组织及外周纤维环分界清晰,细胞核及细胞浆染色明显,缺损退变组显示椎间盘结构紊乱,髓核组织和外周纤维环分界不清;2、Aggrecan番红O染色提示正常对照组及移植组椎间盘染色明显,椎间盘结构清晰,缺损退变组显示椎间盘结构紊乱,髓核组织和外周纤维化分界不清;3、II型胶原免疫组织化学染色:正常对照组以中央髓核组织染色为主,呈黄褐色阳性反应,整个椎间盘结构清晰,移植治疗组中央髓核组织呈阳性反应,细胞间质中可见明显黄褐色,大体结构仍保持完整,缺损退变组染色较前两组浅,且结构不清;4、椎间盘II型胶原蛋白、蛋白聚糖RT-PCR检测结果显示正常组椎间盘组织与移植治疗组的椎间盘组织在Aggrecan和II-collagen基因表达上无明显差异(p>0.05),同时发现缺损退变组Aggrecan和II-collagen的表达明显下调,并与正常组及移植治疗组有明显差异(p<0.05)。结论1.骨髓间充质干细胞来源广泛,取材简单且具有向类髓核细胞分化的优势,是组织工程髓核种子细胞的良好来源;2.壳聚糖具有良好的组织相容性,并可诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化;3.可注射式组织工程髓核可以修复椎间盘缺损退变。