论文部分内容阅读
病原卵菌包括疫霉菌、霜霉菌和腐霉菌等能够侵染马铃薯、柑橘等重要作物的植物病原菌,严重威胁作物的可持续生产。由于进化上与真菌差异巨大,许多杀真菌剂对疫霉菌无效,同时疫霉菌群体变异迅速,导致品种抗病性很容易被克服。因此,深入研究植物调控疫霉菌抗性的分子机制,不仅在揭示病原菌-植物互作机理研究中具有重要的理论意义,而且在寻找作物病害防治新途径,保证我国粮食安全上具有重要的实践意义。本文依托实验室前期建立的寄生疫霉菌(Phytophthora parasitica)-拟南芥(Arabidopsis thaliana)亲和互作体系,利用T-DNA插入在乙烯反应转录因子(ERF019)启动子上游的拟南芥抗寄生疫霉菌突变体267-31,结合遗传学的方法证明了ERF019负向调控植物抗病性,并通过分子生物学和生物化学的方法揭示了其负向调控抗病性的分子机制。此外,本文还初步分析了本氏烟(Nicotiana benthamiana)中ERF019同源基因的功能以探索ERF019在作物抗病育种中应用的可能性。主要研究内容与研究成果如下:1.利用CRISPR/Cas9编辑技术制备了ERF019的敲除突变体,同时也制备了ERF019的过表达植物转化子材料。通过对突变体和过表达植株进行寄生疫霉菌接菌分析,发现erf019敲除突变体能增强拟南芥对寄生疫霉菌的抗性,而过表达植物更感病,进一步验证并明确了ERF019能负向调控拟南芥对寄生疫霉菌的抗性。2.利用定量RT-PCR检测寄生疫霉菌侵染拟南芥叶片不同时间点ERF019的表达情况,发现ERF019在寄生疫霉菌侵染3h诱导上调表达。外源施加激素处理实验表明,ERF019受SA和Me JA诱导表达,并在处理后1h达到高峰,但对ET前体ACC的处理不敏感。此外,相对于野生型Col-0,SA合成基因ICS1、SA信号通路标记基因PR1、JA合成基因LOX2以及JA信号通路标记基因PDF1.2和VSP2在多个erf019突变体中均上调表达,而ET合成基因ACS2和ACS6以及ET信号通路标记基因EIN2和ERF6在erf019突变体和野生型Col-0中没有明显差异。因此,ERF019可能通过参与SA和JA信号通路,调控拟南芥对寄生疫霉菌的防御反应。3.本氏烟中异源表达拟南芥ERF019促进寄生疫霉菌侵染。融合核输出信号肽的ERF019蛋白丧失了其促进侵染的能力,融合突变了的核输出信号肽的ERF019则不受影响。利用地塞米松诱导的核重定位系统,制备了ERF019融合小鼠糖皮质激素受体(GR)的转基因植株,发现地塞米松诱导后的ERF019-GR的核定位能促进寄生疫霉菌的侵染。这些结果说明,ERF019的细胞核定位对于其促进寄生疫霉菌侵染非常重要。4.ERF019负向调控PAMP激发的免疫反应。Western blot检测表明PAMP分子flg22诱导的MAP激酶磷酸化在多个erf019突变体中显著增强,而在ERF019过表达植株中受到抑制。同时DAB染色和酶活法检测过氧化氢积累和ROS迸发的结果表明,flg22激发的过氧化氢的积累和ROS迸发在ERF019过表达植物中明显减弱。此外,在本氏烟上异源过表达ERF019能抑制INF1引发的细胞坏死。5.ERF019的免疫功能保守,探索了ERF019在本氏烟中的同源基因Nb19在植物免疫中的潜在功能。Nb19受寄生疫霉菌和flg22诱导表达。过表达Nb19能抑制flg22介导的FRK和WRKY33的表达以及ROS的迸发,并促进寄生疫霉菌的定殖。同时利用VIGS技术沉默Nb19后不影响植株生长,同时相对沉默GFP的对照,沉默Nb19后能促进INF1以及Bax引发的细胞坏死。综上所述,本研究通过遗传学、分子生物学以及生物化学等方法,发现ERF019通过抑制PAMP激发的免疫反应来负向调控植物对寄生疫霉菌的抗性。后续利用免疫共沉淀-质谱联合分析筛选鉴定ERF019互作蛋白以及使用Ch IP-Seq寻找ERF019直接调控的靶基因将为我们深入了解ERF019的负调控植物植物免疫机制提供更多的数据支撑。考虑到erf019突变体在抗病的同时并不影响植物生长发育过程,研究作物中ERF019同源基因或其调控通路中其他基因的功能将会为抗病育种提供重要的理论依据。