白刺链霉菌(Streptomyces albospinus)CT205活性成分的分离纯化及其对草莓根腐病的生防效应研究

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hbb88191312
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农用抗生素是由微生物产生的用于防治农业有害生物的次级代谢产物,放线菌作为农业微生物的重要类群,约有70%的抗生素是由放线菌产生的,其次生代谢产物是农用抗生素的重要来源。草毒根腐病(strawberry root rot)是一种由多种病原微生物所引起的土传病害,通过病原微生物侵染草莓根部发病,导致根部腐烂,叶片萎蔫,最终造成整株枯死,严重制约了草莓栽培行业的发展。通过生物防治的方法来控制草莓根腐病是目前研究的热点。白刺链霉菌(Streptomyces albospinus)CT205是实验室保存的一株拮抗放线菌,具有较强的抗菌效果和广泛的抗菌谱。本论文以S.albospinus CT205为材料,首先对其液体发酵培养基及发酵条件进行优化,然后对发酵液中的活性成分进行分离纯化及检测,之后对其固体发酵培养基进行优化,制备生防制剂,最后通过盆栽及田间试验探究了S.albospinus CT205液体发酵菌剂和固体发酵菌剂对草莓根腐病的生防效应。研究结果如下:采用单因素实验和正交实验相结合的方法,以啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为指示菌,对发酵液的抗菌活性进行检测,并佐以菌浓度作为优化指标,对白刺链霉菌CT205发酵培养基和发酵条件进行了优化。最终获得优化配方:蔗糖2.0%,可溶性淀粉 3.0%,蛋白胨0.2%,黄豆粉0.8%,MgSO4.7H2O 0.05%,K2HPO4 3H2O 0.05%,NaCL0.2%,CaCO30.3%;最佳发酵条件为:初始pH8.0,发酵温度为28℃~30℃,接种量10%,装液量为100mL/500mL。采用薄层层析法对发酵液中的活性成分进行初步分离,并经生物检测发现,发现组分4对啤酒酵母(S.cerevisiae)和草莓根腐病病原菌(Fusarium oxysporum)Y3具有抗菌活性,Rf值为0.68。进一步对组分4全波长紫外扫描发现,该活性物质在258nm处有一强紫外吸收峰。采用高效液相色谱仪对组分4进行纯化,获得了一种具备抗菌活性的白色晶体物质。通过对该物质进行一级质谱分析,推测其分子量可能为273.2、317.2 和 436.1。通过对菌株CT205固体发酵配方的优化,得到优化配方:蚯蚓粪:麦麸(W:W)=1:1,料水比(V:V)=1:0.8,28℃,浅盘固体发酵4-6天,获得CT205生防制剂,孢子数量达到3.02×109CFU·g-1。将此制剂用于草莓盆栽及田间试验研究。在南京郊区麒麟镇进行了草莓盆栽试验,结果表明:单独施用CT205液体菌剂和固体制剂对草莓根腐病的防治效果分别达78.57%和88.10%,同时对各处理的生物量、植物酶活和土壤酶活进行测定发现,无论是CT205液体菌剂还是其固体制剂对草莓均具有显著的促生作用;并且单独施用CT205液体菌剂和固体制剂时植物过氧化氢酶(CAT)分别为115.45 U-g-1和471.54 U·-1,分别是对照的24倍和98倍,超氧化物歧化酶(SOD)分别为490.52 U/g和481.77 U/g,比对照处理高5.03%和3.16%;土壤脲酶分别为 305.35 mg/(g·24h)和 230.99 mg/(g·24h),比对照高 53.27%和 15.58%。另外,通过荧光定量PCR法对根际土微生物数量进行测定得知,无论是施加CT205液体菌剂还是固体制剂的处理,其细菌和真菌数量都比对照低。在南京市溧水区傅家边草莓科技园进行田间试验,结果表明:施用固体CT205菌剂可有效防治草莓根腐病,防效达69.3%。
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