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ENTV(Enzootic nasal tumor virus)是一种以呼吸道鼻内粘膜分泌型上皮细胞发生致瘤性转化为特征的接触性传染病病毒,主要发生于绵羊和山羊,其临床症状主要表现为连极度消瘦、续性鼻漏、呼吸困难等,大多数病例以死亡告终。国内对于该病主要在内蒙古、四川和湖南等养羊地区流行。本研究利用ENTV-SC株基因组为模板,建立检测该病的RT-PCR方法,克隆、表达和纯化了 SU蛋白、初步建立ENTV的间接ELISA检测方法。1.羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV RT-PCR检测方法的建立与应用根据GenBank已经收录的ENTV-SC株的基因序列,设计了一对引物,建立羊鼻内肿瘤病毒ENTV的快速RT-PCR检测方法。用该引物进行RT-PCR扩增,结果得到与试验预计相符的323bp的特异性扩增条带,比对NCBI上的ENTV-SC株同源性达98%;此方法对健康羊鼻粘膜上皮、健康牛鼻粘膜上皮、肺炎球菌和支原体的扩增结果为阴性,最低能检测出6 pg的ENTV病毒核酸,有较好的稳定性和重复性;对收集的100份病料进行检测,并与临床诊断结果进行比较,符合率100%。结果表明,该RT-PCR检测方法可用于羊鼻内肿瘤病毒ENTV的临床诊断和试验研究。2.羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV SU基因的克隆与表达采用RT-PCR方法从羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV)鼻内分泌物中扩增获得SU基因片段,将其克隆到pMD19-T载体。测序验证后,再对克隆载体进行EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切并亚克隆到pET-32a上,将重组质粒转化至表达宿主菌Rostta中进行IPTG诱导表达,对表达产物用SDS-PAGE筛选最适条件。结果显示,表达的重组菌融合蛋白大小约60.14ku,在IPTG终浓度0.75mmol/L,37℃,诱导5h表达效果最好。表达产物通过Ni柱纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。经Western Blot分析,所纯化的蛋白能与兔抗羊鼻内肿瘤病毒ENTV阳性血清进行特异性的免疫印迹反应,证明表达蛋白有较好的反应原性。3.ENTV SU蛋白间接ELISA方法的初步建立以第三章纯化的SU蛋白作为抗原,初步建立了羊鼻内肿瘤病毒间接ELISA检测方法,并优化确定了 ELISA最佳工作条件:血清最适稀释度为1:40,37℃作用90min;重组抗原包被最适浓度为12.5μg/mL,37℃反应1h,4℃过夜;5%脱脂奶粉,37℃封闭2h;二抗最适稀释度为1:4000,37℃作用40min;TMB显色最适时间为15min;判定阴阳性的临界指标为0.421。实验证明本研究建立的ELISA方法具有良好的重复性、敏感性和特异性。