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天冬氨酸酶是一类肽水解酶的总称。它们的来源非常广泛,而且与许多疾病如高血压、胃溃疡、肌肉萎缩以及一些神经类疾病的发生有关。结构研究表明其活性中心由两个羧基构成,研究清楚这种酶的催化方式对于治疗很多疾病至关重要。目前科学家们已经确认在天冬氨酸酶催化中存在着普通酸碱催化,也有科学家认为亲核催化机理也是可行的,但后者还没有得到足够多的证据支持。本文建立了一个人工天冬氨酸酶体系,通过探讨人工酶的催化机理来指导我们认识天冬氨酸酶的催化机理。
本文以氨基酸芳香酯氢卤酸盐为多肽的模型物,并针对它们设计合成了系列分子中含有羧基冠醚化合物1-11,羧基被用于模拟天冬氨酸酶的活性中心。这些化合物分别具有不同长度侧链、不同取向侧链、不同大小冠醚环以及有无羧基的特征,这些都有助于了解人工酶的催化机理信息;此外,我们引入了具有不同大小侧链基团的氨基酸芳香酯氢卤酸盐底物以观察底物对催化活性的影响。
根据底物和冠醚人工酶的结合特征,本文对动力学测试的环境介质进行了优化选择,最终得出在5%甲醇-二氯甲烷(体积比)中能够获得较好的动力学数据。由于催化反应产物在测试环境中吸收光谱基本没有变化,因此动力学测试时体系中没有额外加入缓冲剂。为了体现体系pH值改变对催化效率的影响,我们以Et4NAcO-AcOH作为缓冲剂单独对化合物11进行了动力学检测,发现体系pH值升高时化合物11的催化活性下降。
动力学监测结果表明分子内含有羧基的化合物都体现了对底物的催化溶剂解活性,催化活性最高的化合物4能使甘氨酸对硝基苯酯盐酸盐的反应速率提高近4000倍;而分子内不含有羧基的化合物没有体现活性,这说明羧基确实按照预先设计的那样起了催化作用。分子中连接羧基的侧链有效长度中包含四个碳原子的化合物明显具有较高催化活性,并且随着侧链刚性增强其活性明显增强;而分子结构不符合这个特征的化合物只体现了微弱的催化活性。当体系的pH值升高时,各化合物的催化活性都呈现下降趋势,说明溶剂中的氢离子也在催化机理中扮演了重要角色。综合各种化合物结构-活性效能关系我们提出了“溶剂共轭酸辅助,羧基亲核催化”的机理。这个机理能很好地与动力学监测结果互相印证。
在文章结论部分总结人工酶的催化机理,论证了此机理与天冬氨酸酶亲核催化机理的相关性,并得出最终结论:既然人工天冬氨酸酶能够以亲核催化的方式进行催化,那么天冬氨酸酶也完全有可能采取亲核催化机理。