研究目的日本学者研究发现宫颈胃型腺癌(Gastric-Type endocervical adenocarcinoma,GAC)约占宫颈腺癌的25%,具有侵袭性强,易早期淋巴结转移,且对化疗药物不敏感,预后差等特点,但目前对其研究较少,其病因尚不明确,文献报道,大多数胃型腺癌发现时即伴有子宫、卵巢、网膜及腹腔转移。多药耐药(MDR)是肿瘤细胞在化疗过程中对一种化疗药物产生耐药作用后,同时对其他相同或不同类型的化疗药物也会产生耐药性。多药耐药基因1(MDR-1)是最早研究的肿瘤耐药基因之一。MDR1编码的P-蛋白(p-gp)是ATP结合转运蛋白(ATP binding cassette,ABC)家族成员之一,是一种跨膜转运蛋白,嵌插在细胞的浆膜上,并含有高保守的ATP结合位点,具有ATP酶的活性。本研究旨在探讨宫颈胃型腺癌与普通腺癌中多药耐药P-gp蛋白的表达,研究P-gp蛋白影响宫颈腺癌耐药的分子机制,并且通过外显子测序技术探讨宫颈胃型腺癌的特殊突变基因,为宫颈胃型腺癌寻找特定诊断标志物及个性化治疗靶点。第一章 宫颈胃型腺癌相关免疫表型及多药耐药蛋白P-gp的表达研究方法1.通过回顾性分析山东大学齐鲁医院自2005年1月至2017年12月这13年首诊经病理确诊且病例分型明确的宫颈癌新发病例的病理资料。2.收集山东大学齐鲁医院2009年-2017年子宫颈腺癌组织存档的病例及蜡块,包括114例宫颈腺癌病例,完善相关临床病理参数。3.利用免疫组化方法检测宫颈腺癌组织中P16、MUC6、MUC5AC、CK7等蛋白的表达,并利用PCR检测宫颈腺癌组织中的HPV,结合宫颈腺癌组织的HE染色,筛选宫颈胃型腺癌。4.根据免疫组化结果、HPV的检测及组织的HE染色筛选出宫颈胃型腺癌及宫颈普通腺癌,并比较两种腺癌类型患者的临床病理参数及预后的关系。5.利用免疫组化方法检测宫颈胃型腺癌与普通腺癌中P-gp蛋白的表达,并分析P-gp蛋白与宫颈胃型腺癌患者的临床病理参数和预后的关系。6.利用免疫组化方法检测宫颈胃型腺癌与普通腺癌中β-arrestin2蛋白的表达,并分析P-gp蛋白与β-arrestin 2蛋白在宫颈腺癌中的关系。研究结果1.从2005年-2017年,宫颈鳞状细胞癌均为宫颈癌主要病理类型,占大多数,宫颈腺癌占少数。在2549例宫颈癌病例中,宫颈鳞癌2037例,占79.91%;宫颈腺癌512例,占20.09%。从2005年-2017年宫颈腺癌的构成比来看,宫颈腺癌的发病率是逐渐上升的。2.本研究从2005-2017年共2549例宫颈癌患者,其年龄呈正态分布,最小年龄为17岁,最大为93岁,平均年龄为(49.56±11.34)岁,中位发病年龄是49岁。宫颈癌均以41-50岁为高峰发病年龄,而30岁以下患者所占构成比较小。3.在本研究的2549例宫颈癌患者中,宫颈鳞癌在41-50岁年龄分组中的构成比最高,为32.99%,而宫颈腺癌也是在41-50岁年龄分组中的构成比最高,为34.3 8%。将年龄划分为≤45岁组和45岁以上组,宫颈鳞癌和宫颈腺癌的病例数分析比较后,结果显示χ2=4.388,p=0.036,差异有统计学意义。表明宫颈腺癌的发病年龄较宫颈鳞癌年轻。4.将筛选出的90例宫颈普通腺癌与24例宫颈胃型腺癌进行相关病理临床特征及预后比较,发现宫颈胃型腺癌分化程度比宫颈普通腺癌高(p<0.001),宫颈胃型腺癌较普通腺癌更易侵袭浸润肌层组织(p=0.008),宫颈胃型腺癌较宫颈普通腺癌更易发生早期淋巴结转移(p=0.008),宫颈胃型腺癌患者预后差(p=0.0126)。而宫颈普通腺癌与宫颈胃型腺癌的年龄、肿瘤大小等情况进行组间比较,差异均无统计学意义(p>0.05)。5.免疫组织化学结构显示,P-gp蛋白在宫颈胃型腺癌中的阳性率较宫颈普通腺癌的阳性率高,且多为高表达。P-gp蛋白在胃型腺癌中的表达多为强阳性、高表达,而在普通腺癌中的表达多为弱阳性、低表达(p<0.001,差异具有统计学意义)。6.本研究分析了宫颈胃型腺癌中P-gp蛋白的表达与临床病理特征之间的关系。通过卡方检验分析,P-gp蛋白的表达与肿瘤的分化程度(p=0.022)具有相关性。P-gp蛋白的表达与患者的年龄、肌层浸润深度、肿瘤大小、淋巴结转移等情况无明显相关性。通过Kaplan-Meier进行分析,发现P-gp蛋白的表达对宫颈胃型腺癌及普通腺癌的预后均无显著影响(p>0.05)。7.在90例宫颈普通型腺癌组织中,β-arrestin 2与P-gp蛋白共同表达的病例有17例,占18.89%(17/90);β-arrestin2与P-gp蛋白共同表达阴性的病例有40例,占44.44%(40/90)。经统计学分析发现β-arrestin 2与P-gp在宫颈普通型腺癌组织中呈正相关,Spearman correlation为0.351,具有显著统计学意义(p<0.01)。研究结论1.宫颈胃型腺癌镜下观察一般分化极好,不易鉴别,通过MUC6、P16免疫染色及高危型HPV检测可以帮助鉴别宫颈胃型腺癌。2.宫颈胃型腺癌的分化程度较宫颈普通腺癌高,普遍为高分化。宫颈胃型腺癌比普通腺癌更易发生早期淋巴结转移和高度浸润,且胃型腺癌患者较普通腺癌患者预后差。3.P-gp蛋白在宫颈胃型腺癌中较普通腺癌高表达,可能预示着宫颈胃型腺癌患者对化疗药物的不敏感与P-gp蛋白的高表达有关,对宫颈腺癌的个体化治疗提供了实验依据。4.P-gp蛋白与β-arrestin 2在宫颈普通型腺癌组织中的表达呈正相关。第二章 全外显子测序技术的应用研究方法收集5例宫颈胃型腺癌、4例宫颈普通腺癌、4例宫颈正常组织进行全外显子测序及突变基因生物学信息分析,根据突变频率、GO、KEGG富集分析等因素筛选出感兴趣的突变基因,在DNA水平分析胃型腺癌的增殖转移及其特殊性生物学行为相关基因,以期探索宫颈胃型腺癌的发病机制及胃型腺癌特定诊断标志物。研究结果通过组间比较、GO、KEGG富集分析及相关文献报道,发现胃型腺癌中存在PRAMEF4、IP6K2、MUC4、GDI2、RGS12、CD81、PSMA1、MADD、DCTN2、RAE1等基因的突变,由于上述基因参与机体肿瘤的侵袭及转移、上皮-间质转化、细胞生长及凋亡及各信号通路的转导过程,因此我们猜测这些基因位点的突变与宫颈胃型腺癌的发生发展密切相关,且与宫颈胃型腺癌易早期侵袭、淋巴结转移的特殊生物学行为密切相关。