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研究目标分析不同高危型别HPV单一和多重感染状态下子宫颈癌相关危险因素和分子指标的差异,探讨HPV感染状态与子宫颈癌及癌前病变的关系;基于机器学习的方法,利用上述指标构建子宫颈癌筛查综合模型,评价该模型用于子宫颈癌筛查的效果。材料与方法本研究采用以医院为基础的多中心横断面研究设计,2014年4月-2017年8月从7家研究中心入组参加子宫颈癌筛查的正常和轻度病变的妇女,以及医院门诊诊断为子宫颈癌和癌前病变的患者,进行子宫颈癌危险因素问卷调查,并取两份子宫颈脱落细胞标本。第一份标本用棉签拭子采集,用于HPV16/18E6癌蛋白检测;第二份标本用宫颈采样刷收集,放入ThinPrep细胞保存液中,分装后用于薄层液基细胞学检查、高危型HPV DNA检测和p16/Ki-67双染细胞学检查。筛查人群四种检测任意阳性召回进行阴道镜检查并取活检;门诊患者在治疗前取子宫颈标本用于以上四项检测。检测剩余的细胞保存液冻存于超低温冰箱。2016年7月-2017年9月,使用剩余保存液样本进行高危型HPVDNA分型检测、高危型HPVE6/E7mRNA和HPV16/18/45E6/E7mRNA检测。HPVDNA分型检测针对14种高危型HPV,可以单独报告HPV16、18、31、45、51和52共6种型别结果,其余8个型别分为3组(HPV33/58、HPV59/56/66、HPV35/39/68)进行报告。根据分型检测结果,将阳性样本的感染状态分为3组:1.明确单一感染组,包括HPV16、18、45、31、51和52单一通道检测阳性;2.可能单一感染组,包括HPV33/58、HPV59/56/66和HPV39/68/35单一通道检测阳性;3.多重感染组,两个及以上通道检测阳性。基于危险因素和分子检测结果,分析不同HPV感染状态下各分子指标的表达情况及其用于子宫颈癌筛查的效果,并通过逻辑回归、随机森林和支持向量机的方法构建子宫颈癌筛查综合模型。研究结果1.高危型HPV明确单一感染、可能单一感染和多重感染在正常/CIN1妇女中所占比例相当,分别为33.7%,35.4%和30.9%;而在CIN2/3患者中,明确单一感染(46.8%)和多重感染(37.2%)所占比例均有所上升,可能单一感染比例下降(16.1%);在SCC/ADC患者中,明确单一感染比例显著增加(70.3%),可能单一感染比例显著下降(5.4%),而多重感染占比略微下降(24.3%)。多重感染HPV E6/E7 mRNA总表达率(明确单一感染vs.可能单一感染vs.多重感染:87.0%vs.76.2%vs.92.5%,χ2=37.865,P=0.001)高于单一感染。多重感染妇女的细胞核p16单染、细胞浆p16单染、细胞核Ki-67单染、任意p16蛋白染色、任意Ki-67蛋白染色、以及p16/Ki-67双染的阳性率均略高于明确单一和可能单一感染,其中p16/Ki-67双染阳性率在不同感染状态之间的差异最为明显(明确单一感染vs.可能单一感染vs.多重感染:61.2%vs.38.7%vs.54.4%,χ2=56.669,P<0.001)。2.HPV16和HPV18不同多重感染型别组合的HPV16/18/45 E6/E7 mRNA和HPV16/18E6癌蛋白的阳性率有差异,例如,最易于表达HPV16E6/E7mRNA和E6癌蛋白的型别组合为HPV16/52(mRNA vs.E6癌蛋白:87.0%vs.71.0%),最不易表达HPV16 E6/E7 mRNA和E6癌蛋白的型别组合为HPV16/45(mRNA vs.E6癌蛋白:66.7%vs.14.3%)。各病变级别妇女HPV16/18单一感染的E6/E7mRNA均高于多重感染;正常和癌前病变妇女HPV16/18单一感染的E6癌蛋白阳性率与多重感染无差异,而癌症患者HPV16/18单一感染的E6癌蛋白阳性率高于多重感染。HPV16/18 共感染的 HPV16E6/E7mRNA 阳性率(59.4%)与 HPV18/45E6/E7mRNA阳性率(62.5%)较为接近,其合并阳性率(100.0%)接近于HPV16(98.7%)和HPV18(100.0%)单一感染的mRNA阳性率,且均高于HPV16/18任意多重感染组合中其mRNA 阳性率。HPV16E6癌蛋白阳性率(46.4%)与HPV18E6癌蛋白阳性率(39.3%)相差较小,其合并阳性率(78.6%)接近于HPV16(76.4%)和HPV18(74.4%)单一感染的E6癌蛋白阳性率。3.高危型HPVDNA、E6/E7mRNA、p16/Ki-67单染或双染的筛查灵敏度较高,而特异度较低;HPV16/18 DNA、HPV16/18/45 E6/E7 mRNA 以及 HPV16/18 E6 癌蛋白的筛查特异度较高,而灵敏度较低。本研究人群中高危型HPVE6/E7 mRNA筛查效果最优(灵敏度:94.1%,特异度:76.4%),p16/Ki-67双染(灵敏度:85.1%,特异度:79.3%)和高危型HPVDNA(灵敏度:91.9%,特异度:66.8%)次之,p16(灵敏度:92.2%,特异度:12.7%)或Ki-67(灵敏度:94.7%,特异度:10.7%)蛋白单独用于筛查的效果不佳。4.通过变量筛选,基于高危型HPVE6/E7mRNA,HPV16/18 E6癌蛋白,p16/Ki-67双染,以及年龄4个变量建立的逻辑回归模型(灵敏度:90.0%,特异度:93.2%)、随机森林模型(灵敏度:91.5%,特异度:89.9%)和支持向量机模型(灵敏度:92.0%,特异度:90.9%)在本研究人群中用于子宫颈癌筛查的灵敏度和特异度均较高,其筛查效果显著优于任意分子指标单独筛查的效果。研究结论1.不同高危型别HPV单一和多重感染状态下子宫颈癌相关分子指标表达有差异,多重感染中表达E6癌蛋白的型别可能是引起子宫颈病变的型别。2.子宫颈癌相关分子指标用于人群筛查各有特点,难以同时获得较高的灵敏度和特异度,而基于高危型HPVE6/E7mRNA,HPV16/18E6癌蛋白,p16/Ki-67双染,以及年龄4个变量共同构建的子宫颈癌筛查模型灵敏度和特异度均较高。