c-Abl（cellular Abelson gene）是Abelson鼠白血病病毒原癌基因v-abl在细胞内的同源物，位于人的9号染色体上，并广泛表达于哺乳动物的各种组织细胞中。Abl家族包括两个成员c-Abl和Arg（Abl-related gene），分别由ABL1和ABL2基因编码。c-Abl和Arg在结构和功能上极为相似，其N端的Src-homoloy3（SH3）、SH2以及PK结构域高度同源。SH2结构域识别并结合可被磷酸化的酪氨酸残基序列（pYXXP），SH3结构域特异性结合富含PXXP的脯氨酸序列。C端的DNA结合序列和核定位信号能够促使c-Abl进行核质穿梭。作为非受体酪氨酸激酶，c-Abl能够与许多其他蛋白质发生相互作用并通过其酪氨酸激酶活性介导底物蛋白酪氨酸磷酸化从而调控细胞黏附、氧化应激、DNA损伤修复、细胞凋亡、细胞转化以及细胞迁移等生命活动，发挥重要的生理功能[1-4]。c-Abl广泛分布于细胞内多种亚细胞结构中，并且不同的细胞定位发挥不同的功能。有趣的是，c-Abl在细胞核中的分布受到DNA损伤的调控，c-Abl参与调节转录后加工过程，其可结合并磷酸化剪接因子如YT-521B，进而影响其对某些基因的可变剪接识别能力[5]。　　为进一步研究c-Abl功能的分子机制，实验室前期酵母双杂交实验获得了一系列与c-Abl结合的目标蛋白，其中发现RBM39（RNA binding motif protein39）可能是c-Abl的下游分子。RBM39也称HCC1.4（hepatocellular carcinoma1.4），首先作为一个肝细胞癌患者的自身抗原被发现，并且其可作为v-Rel介导的淋巴细胞转移的抑制剂。除此之外，也可作为AP-1（activating protein-1）、雌激素受体ERα（estrogen receptor）和孕激素受体PRβ（progesterone receptor）的转录共激活因子进而调控其转录过程并促进转录起始[6,7]。RBM39是由530个氨基酸所组成，蛋白分子量约为59kDa，作为一个潜在的SR-rich（Serine/arginine-rich）剪接蛋白，RBM39包含三个RRM（RNA recognition motif）和pre-mRNA剪接必须的富含精氨酸/丝氨酸的结构域RS（Arg/Ser-rich），与已知的可变剪接因子U2AF65（U2 snRNP auxiliary factor65kDa subunit）蛋白有着高度的序列同源性，但缺少一个U2AF配体模序[8]。免疫萤光显微镜实验显示RBM39与剪接因子SC35和富含尿嘧啶的snRNAs（small nuclear RNAs）共定位于核斑上。实验室前期工作表明c-Abl能够介导U2AF65磷酸化修饰并影响其核质穿梭，从而调控其在可变剪接中的功能。而RBM39作为剪接因子U2AF65的同源蛋白，其如何参与可变剪接，同时有关RBM39如何被调控研究甚少。此外，c-Abl是否可以通过调控RBM39进而影响其作为AP-1，ERα和PRβ的转录共激活因子的转录共激活活性目前还不清楚。　　本研究在酵母双杂交实验基础上，对非受体酪氨酸激酶c-Abl与RBM39相互作用， RBM39核质分布，可变剪接以及影响转录共激活活性方面进行了研究。　　本研究通过免疫共沉淀、免疫印迹方法证明c-Abl与RBM39在293T细胞内形成免疫复合物，外源表达Flag-RBM39和Myc-c-Abl同样存在相互作用。GST-pull down 实验证明c-Abl和RBM39直接相互作用，并且c-Abl是通过SH2、SH3结构域与RBM39结合，其中与 SH2结构域结合最强。通过酪氨酸磷酸化抗体的免疫共沉淀实验发现， c-Abl能使RBM39酪氨酸磷酸化。接着，质谱分析发现RBM39的两个磷酸化位点Y95和Y99。进一步通过构建RBM39相应磷酸化位点的突变体发现各突变体的磷酸化水平均有不同程度的降低，但都没有消失，提示RBM39上还存在其他的磷酸化位点。因此接下来我们找到了RBM39上符合酪氨酸激酶活性特征性磷酸化基序YxxP的另外两个位点 Y405和 Y505，并相应也进行了突变，结果表明当四个位点同时被突变时，磷酸化消失，这些结果提示Y95和Y99是两个主要的磷酸化位点，并且Y405和Y505也被磷酸化，尽管没有通过质谱鉴定出来。免疫荧光结合激光共聚焦显微镜实验显示， RBM39在野生型MEF细胞中均匀分布，而在c-Abl缺失的DKO细胞中由细胞核向细胞质转移。在MEF及DKO细胞中体外转染Flag-RBM39和Flag-RBM39(Y95FY99F)，结果显示Flag-RBM39在MEF细胞中均匀分布，在c-Abl缺失时由细胞核向细胞质转移，而无论 c-Abl存在与否，Flag-RBM39(Y95FY99F)均只出现在细胞质中，这一结果说明c-Abl介导的酪氨酸磷酸化修饰能够促进RBM39的核质穿梭。　　通过双萤光素酶报告系统检测发现，c-Abl能够增强RBM39作为ERα和PRβ的转录共激活因子的转录共激活活性，而其酪氨酸位点突变体却显著抑制此活性。结果表明c-Abl介导的酪氨酸磷酸化修饰能够促进RBM39对ERα和PRβ的转录共激活活性，Y95和Y99以及其他磷酸化位点能够激活RBM39作为共激活因子的活性。此外我们发现与RBM39 knockdown细胞相比，c-Abl在RBM39过表达的细胞中的作用更强。表明c-Abl所调控的ERα和PRβ的转录活性主要是通过（但可能不仅仅）与RBM39的相互作用来实现的。　　此外，本研究通过转录组测序技术和紫外交联免疫沉淀结合高通量测序对RBM39-RNAi以及对照组样品检测RBM39介导的可变剪接事件。结果发现RBM39调节基因转录水平，并广泛参与了可变剪接，其中被调控的剪接类型以盒式外显子模式为主。同时通过GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析显示所调控的可变剪接相关基因主要涉及G2/M转变，细胞DNA损伤反应，附着连接和内吞作用。同步地我们对比了RBM39同源蛋白U2AF65的转录组测序结果，发现它们两者所调控的剪接事件约有20％的重叠，表明RBM39可能通过一个与U2AF65相似的，或者与U2AF65直接结合，或者募集类似U2AF65的剪接因子的方式对可变剪接进行调控。此外我们也对 RBM39的紫外交联免疫沉淀结合高通量测序中 Ablife和Piranha方法发现的结合峰进行了模序分析，发现 RBM39结合的一致性序列为AGTCCGACGAT。有趣地是，RBM39的结合位点显著富集在转录起始和终止位点，这些结果提示这些结合位点可能与 U2AF65的3’剪接位点有着序列相似性，具体的结合机制有待深入研究。我们观察分析c-Abl的转录组测序数据，发现其参与调节可变剪接， 之后将其与RBM39的转录组数据进行overlap，结果显示c-Abl所调控的可变剪接有一部分是通过RBM39实现的，提示RBM39调控的可变剪接可受c-Abl的调节。　　综上所述，本研究主要得到以下结果：c-Abl与 RBM39在细胞内和细胞外形成免疫复合物；RBM39与c-Abl的SH2和SH3结构域直接结合；c-Abl能够介导RBM39酪氨酸磷酸化修饰，Y95和Y99为主要磷酸化位点；c-Abl介导的酪氨酸磷酸化能够影响RBM39的核质穿梭；c-Abl介导的RBM39酪氨酸磷酸化能够调控RBM39作为ERα和PRβ的转录共激活因子的转录共激活活性，并且RBM39的Y95、Y99以及其他的磷酸化位点激活了其作为共激活因子的活性；RBM39调节基因转录水平；RBM39广泛参与调控可变剪接，其中以盒式外显子类型为主；RBM39所调控的可变剪接相关基因主要涉及G2/M转变，细胞DNA损伤反应，附着连接和内吞作用；最重要的是，RBM39与U2AF65调控的可变剪接事件有约20%的重叠，提示RBM39和U2AF65可能在可变剪接调控上有着相似的机制；RBM39结合 mRNA最显著的一致性序列为AGTCCGACGAT，并且结合位点显著富集在转录起始和终止位点，提示可能的结合机制；RBM39调控的可变剪接可受c-Abl的调节。　　通过c-Abl与RBM39的相互作用及其生物学意义的研究，证明c-Abl非受体酪氨酸激酶与剪接因子RBM39存在相互作用并介导其磷酸化。并对c-Abl酪氨酸激酶参与调控RBM39的转录共激活活性进行了研究，为c-Abl在乳腺癌方面的功能研究提供线索。通过全基因组的角度对RBM39和c-Abl是否参与可变剪接以及如何调控可变剪接的机制进行了研究和探讨。对深入认识c-Abl酪氨酸激酶在乳腺癌以及基因转录和可变剪接方面的功能具有重要的理论意义。